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固相PH梯度等电聚焦电泳

点击： 作者： 来源： 时间： 2007-11-08 　本站论坛

仪器试剂
　　仪器：Pharmacia公司IPG Phor系统
　　试剂：
1. 丙稀酰胺；
2. 双－丙稀酰胺；
3. Immobiline II；
4. 过硫酸铵；
5. TEMED
　　储存液：
1. 溶解14.55g丙稀酰胺和0.45g N，N‘－双甲叉丙稀酰胺于40ml双蒸水中，溶解过滤后定容至50ml，4摄氏度可以存放2周。
2. Immobiline II，使用前将储存于4－8摄氏度的Immobiline II溶液于室温下平衡半小时。
固定化电解质的选择
　　固定化电解质可以分为酸性和碱性固定化电解质，分别含有一个弱的羧基和氨基，商品化的固定化电解质有6-7种，但是实验室已可合成不同pK值的丙稀酰胺衍生物17种，利用不同pK固定化电解质的组合可以配置不同pH范围的凝胶，甚至一个pH范围及小于一个pH范围的凝胶，现在已经可以从10种不同pK的固定化电解质中选择缓冲离子和滴定剂，设计pH2.5-12任意宽窄范围的pH配方，也有很多中pH范围商品化的固相pH梯度凝胶出售。
　灌胶：
通常将酸性固定化电解质作为重液，碱性固定化电解质作为轻液，下表为凝胶配方：
表2 固相pH梯度凝胶配方

贮液	重液（混合腔）	轻液（贮液腔）
缓冲固定化电解质	ul	ul
滴定固定化电解质	ul	ul
甘油	2.1ml	――
丙稀酰胺单体贮液	1.25ml	1.25ml
双蒸水定容到	7.5ml	7.5ml

不同pH梯度范围加入的固定化电解质的量不同，参见下表
表3

酸性溶液体积（ul）							碱性溶液体积（ul）
0.2M固定化电解质pK							0.2M固定化电解质pK
3.6	4.6	6.2	7.0	8.5	9.3	pH范围		3.6	4.6	6.2	7.0	8.5	9.3
299	223	157				3.5-5.5		212	310	465
569	99	439				4.0-6.0		390	521	276			722
415	240	499				4.5-6.5			570	244	235		297
69	428	414				5.0-7.0			474	270	219		320
	450	354	113			5.5-7.0		347		236	287	284
435		323	208	44		6.0-8.0		286		174	325	329
771		276	185	538		6.5-8.5		192		153	278	362
1349		272	372	845		7.0-9.0		207			925	139	346
399			364	355	94	8.0-10.0		91			329	366	289
587	110	450				4.0-7.0		302	738	151	269		876
702	254	416	133	346		5.0-8.0		175	123	131	345	346
779		402	93	364	90	6.0-9.0		241		161	449	237	225
542			378	351		7.0-10.0		90			324	350	280
588	254	235	117	170		4.0-8.0			554	360	142	334	288
830	582	218	138	795	122	5.0-9.0			249	263	212	292	230
941		273	243	260	282	6.0-10.0		100		333	361	239	326
829	235	232	22	250	221	4.0-9.0		147	424	360	296	71	663
563	463	298	273	227	127	5.0-10.0		21	59	34	420	310	273
1102		455	89	334		4.0-10.0			114	50	488	157	357

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