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等电聚焦注意事项

点击： 作者： 来源： 时间： 2007-11-08 　本站论坛

1. 等电聚焦后可用一根染色的细线（0.1mm）标出染料前沿的位置；
2. 不同品牌的载体两性电解质性质上有细微的差别，使用不同来源的载体两性电解质凝胶时候蛋白质分离样式略有差异，若要获得最好的重复性一般不要更换载体两性电解质的品牌；
3. 通常，窄范围的pH梯度可以提高分辨率，但是需要时间也比较常，pH梯度范围为2是较好的选择；
4. 由于电源和凝胶冷却系统的限制，最长的凝胶长度为8－10cm，实际上，分别电泳几块不同的pH梯度的凝胶比只电泳一块较长凝胶效果更好；
5. 当等电聚焦电泳时间很长时候（〉3000V·h），由于载体两性电解质不稳定造成的阴极漂移将成为严重问题，阴极漂移会破坏pH梯度，尤其是pH8以上的梯度，为了克服此问题，开发了一种较短时间（1600V·h）完成等电聚焦电泳的技术，即非平衡pH梯度电泳，这样可以在高pH范围内聚焦蛋白质，但该方法不能用来测定蛋白质等电点。
6. 尿素可以促进蛋白质溶解，并消除蛋白质－蛋白质及蛋白质－脂类相互作用，可增加聚焦速度和提高分辨率，同时抑制阴极漂移，但是也要注意变性蛋白质的等电点可能同天然蛋白有所差异。
7. 若蛋白溶液中含有SDS，可加入尿素至终浓度8M，在高浓度的尿素下，SDS同蛋白质的相互作用极小。
8. 在变性液中加入2％Triton X－100以保证蛋白质（尤其是膜蛋白）的充分溶解，有些作者推荐使用如CHAPS和Zwittergent3－14等两性离子去垢剂；
9. 超薄凝胶（50-500um）比常用标准等电聚焦更有优势，因为高电场强度和更佳的冷却效果使聚焦速度更快，分辨率更高。
10. 在聚丙烯酰胺等电聚焦凝胶中，高分子量蛋白质（〉750kd）常常表现异常的迁移行为，琼脂糖凝胶或琼脂糖－丙稀酰胺凝胶较适用于高分子量蛋白质。
11. 考马斯亮蓝染色中，三氯乙酸固定后用0.25％SDS的乙醇：醋酸：水（33：10：57）溶液洗涤凝胶10-30min可以进一步改善染色效果。SDS同载体两性电解质结合后可以更好的去除载体两性电解质。

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