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蛋白测定－BCA法

点击： 作者： 来源： 时间： 2007-11-06 　本站论坛

原理
　　　Bicinchoninic acid (BCA )法是近来广为应用的蛋白定量方法。其原理与Lowery法蛋白定量相似，即在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+。BCA与Cu1+结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562 nM处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。与Lowery法相比，BCA蛋白测定方法灵敏度高，操作简单，试剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳，并且受干扰物质影响小。与Bradford法相比，BCA法的显著优点是不受去垢剂的影响。
器材
1. 7220型分光光度计
2. 比色杯
3. 恒温水浴箱
4. 中试管7支
5. 枪式移液管
试剂
1. 试剂A： 1％BCA二钠盐
                  2％无水碳酸钠
                  0.16%酒石酸钠
                  0.4％氢氧化钠
                  0.95％碳酸氢钠
混合调PH值至11.25。
2. 试剂B：4％硫酸铜。
3. CA工作液：试剂A?100ml?＋?试剂B?2ml混合。
4. 蛋白质标准液：用结晶牛血清白蛋白根据其纯度用生理盐水配制成1.5mg/ml的蛋白质标准液。（纯度可经凯氏定氮法测定蛋白质含量而确定）
5. 待测样品：用双缩脲测定法的样品稀释而成。
操作
标准曲线的绘制：取试管七支、编号，按下表操作：

试剂

空白管

测定管

蛋白质标准液(mg)(1.5mg/ml)

100

双蒸水(mg)

待测样品(mg)

100

BCA工作液(ml)

计算
1. 绘制标准曲线。
2. 以测定管吸光度值，查找标准曲线，求出待测血清中蛋白质浓度(g/L)。
3. 再从标准管中选择一管与测定管光密度相接近者，求出待测血清中蛋白质浓度(g/L)。
特点
1. 操作简单，快速，45分钟内完成测定，比经典的Lowary法快4倍且更加方便；
2. 准确灵敏，试剂稳定性好，BCA试剂的蛋白质测定范围是20-200μg/ml，微量BCA测定范围在0.5-10μg/ml。
3. 经济实用，除试管外，测定可在微板孔中就进行，大大节约样品和试剂用量；
4. 抗试剂干扰能力比较强，如去垢剂，尿素等均无影响；
5. 配液工作比较麻烦。
　　此法测定蛋白质浓度，近些年被科研工作者广泛选用。目前BCA法的试剂盒市面有售。总之，虽然蛋白质含量的测定方法很多，但是，还没有一个完美的方法。在选择测定方法时，可根据实验要求和实验室条件决定。

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