绿色荧光蛋白在蛋白质研究中的应用-试验方案

利用大肠杆菌进行蛋白大量表达时，常常会造成蛋白质错误折叠和聚集沉淀。已有的增加蛋白可溶性表达的方法包括—靶蛋白与溶解性好的蛋白融合表达、靶蛋白与促折叠剂及伴侣蛋白共表达、低温表达、改善培养条件等等。但并不适用于所有情况，因为没有从本质上改变控制蛋白折叠和可溶性的因素。Waldo等利用GFP只有在自身折叠正确的情况下产生荧光的特性和能在基因水平操作的优点，将随机突变后的目的蛋白以C端同GFP融合，在大肠杆菌中构建表达文库。荧光筛选和SDS验证表明，GFP的折叠和发光集团的形成与上游蛋白的正确折叠及可溶性直接相关。此后，Pedelacq等进一步利用GFP指示筛选到可溶性提高的甲基转移酶、NDP激酶，并通过X光衍射实验得到了进化的NDP激酶的结构。van den Berg等研究人员利用这种方法，通过易错PCR（error-prone PCR）增加了TEV蛋白酶在大肠杆菌中的可溶性表达。Kawasaki等将T-PCR（tagged random primer PCR）扩增与GFP标记筛选方法相结合，从小鼠Vav蛋白中克隆到4个可溶结构域。

针对GFP折叠报告系统存在的问题，比如在蛋白定向进化中可能得到由于在内部隐蔽核糖体结合位点错误起始翻译造成蛋白截短以及不适合应用于由于缓慢聚集而形成的不溶性蛋白，Cahantous等在GFP折叠报告系统的基础上加入了split-GFP补偿系统，对基于GFP的可溶性蛋白筛选方法进行了改进。

利用微生物进行蛋白大量表达，寻找能够减少蛋白的非正确折叠的适宜的蛋白表达条件必不可少。然而，传统的筛选步骤，如：免疫转渍分析、琼脂糖凝胶电泳检测等，比较繁琐、费时，并且只能基于个体水平进行，为表达条件的优化带来不便。Omoya等研究人员根据GFP与蛋白融合表达时表现出的特性，以GFP作为标记，通过对hIL-18-GFP在不同表达条件下（培养温度、诱导剂浓度、培养时间）荧光强度的测定，使hIL-18的表达条件得到优化，提高了终产物产量，并通过SDS-PAGE检测对这一结果进行了证实。Rucker等也作了类似研究。

绿色荧光蛋白作为一种稳定的自发荧光的标记分子，在分子生物学和细胞生物学领域有广泛的应用。而荧光共振能量转移（FRET）又为GFP的应用提供了进一步的技术支持。但是，野生型GFP的实际应用存在很多问题，比如信号强度弱、复杂的光化学性质等等。目前，实验室中已经得到了很多GFP的突变体，增加了亮度和折叠效率，降低了寡聚作用，带来更稳定的物理化学性质，并且改变了吸收和发射光谱。例如：增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）、人工绿色荧光蛋白（GFPh）、S65T-GFP、蓝色荧光蛋白（blue fluorescent protein，BFP）、红移型绿色荧光蛋白（red-shifted green fluorescent proein，RSGFP）等。这些GFP的突变体为分子和细胞生物学的发展提供了强大的推动力。

除此之外，GFP蛋白仍有一些不足，主要表现在GFP对靶蛋白可能的影响，如：标记蛋白的表达量增加，影响蛋白的功能和定位。GFP荧光活性形成比较慢，对某些细胞动力学过程不能实时监测。GFP标记检测中也存在一定问题。细胞聚合物、杂质和培养基中其他吸光或散光的化合物，能够形成“内滤现象”（inner filter effect，IFE），影响培养基GFP的荧光检测。