【原理】
Western blotting是利用抗体作探针来检测已转移到固相支持物上的靶蛋白。一般先用待测蛋白免疫动物A，获得多克隆或单克隆抗体作为第一抗体与靶蛋白反应，再用另一种动物的抗动物A的免疫球蛋白抗体(放射性标记或酶标记)作为第二抗体。通过放射自显影或特异性酶促反应对固相支持物上的靶蛋白进行检测。这样避免了对每种待测蛋白都要制备放射性标记或酶标记抗体的麻烦。
本实验利用辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人IgG抗体直接检测人血清IgG，无需再用第二抗体。先将人血清上样进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过转移系统将蛋白质从凝胶转移到硝酸纤维膜上，再用丽春红S(Ponceau S)对硝酸纤维膜染色并用铅笔标出分子量标准的条带(该染料只会短暂显色，进行Western印迹时可被洗去，且与所有免疫学检则方法兼容)，漂洗后再用封闭液(本实验采用牛血清白蛋白)封闭膜上可能结合非相关蛋白的位点以降低非特异性结合的背景，封闭之后滤膜加入酶联抗体温育，漂洗后加入生色底物进行特异性显带。免疫偶联的辣根过氧化物酶最敏感的底物是3，3＇-二氨基联苯胺，它在过氧化物酶所在部位转变成棕色沉淀。在Co2＋或Ni2＋存在下可以加深沉淀的颜色并提高反应的灵敏度。
IgG是由两条轻链和两条重链通过二硫键连接起来，变性后轻链和重链分开，且在轻链和重链的恒定区都具有抗原决定簇，因此在膜上可以显出两条带，一条为轻链(约21KD)另一条为重链(约为57KD)。
【操作】
1．SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：见实验二十七，样品为20倍稀释的血清或用实验二十三：A蛋白吸附法纯化血清中IgG的洗脱液，经处理后与蛋白质标准一起上样。
2．电泳即将结束时，切6张Whatman 3MM的滤纸和1张硝酸纤维素滤膜，其大小都应与凝胶大小完全吻合，放入转移缓冲液中浸泡5min以上。
3．在一边的海绵垫上放置3张用转移缓冲液浸泡过的3MM滤纸，逐张叠放，精确对齐，然后用一玻璃移液管作滚筒以挤出所有气泡。把硝酸纤维滤膜放在3MM滤纸堆上，要保证精确对齐，而且在3MM滤纸与滤膜之间不留有气泡。从电泳槽上撤出放置SDS-聚丙烯酰胺凝胶的玻璃，把凝胶转移到一盘去离子水中略为漂洗一下，然后准确平放于硝酸纤维素滤膜上，排除所有气泡。把最后3张3MM滤纸放在凝胶上方，同样须确保各层精确对齐并不留气泡。
4．夹紧夹子，按图8-2装置好，确保凝胶在负极，滤膜在正极，倒满转移缓冲液稳流100mA转移2~3h。
5．关闭电源拆下转移装置，把凝胶转移到盛有考马斯亮蓝染液的托盘中进行染色，以便检查蛋白质转移是否完全。将硝酸纤维膜转移到含有丽春红S使用液的托盘中染色5～10min，其间轻轻摇动染液，蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤膜，其间换水数次。
上一篇：Southern印迹 下一篇：放射自显影术
共2页: 上一页 1 [2] 下一页
