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酶联免疫吸附技术（ELISA）的操作要点

点击： 作者： 来源： 时间： 2007-04-08 　本站论坛

6 显色和比色
6.1 显色
显色是 ELISA 中的最后一步温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。在定量测定中，加入底物后的反应温度和时间应按规定力求准确。定性测定的显色可在室温进行，时间一般不需要严格控制，有时可根据阳性对照孔和阴性对照孔的显色情况适当缩短或延长反应时间，及时判断。
OPD 底物显色一般在室外温或37℃反应20-30 分钟后即不再加深，再延长反应时间，可使本底值增高。OPD 底物液受光照会自行变色，显色反应应避光进行，显色反应结束时加入终止液终止反应。OPD 产物用硫酸终止后，显色由橙黄色转向棕黄色。
TMB 受光照的影响不大，可在室温中置于操作台上，边反应观察结果。但为保证实验结果的稳定性，宜在规定的适当时间阅读结果。T MB 经HRP 作用后，约40 分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至2 小时后即可完全消退至无色。TMB 的终止液有多种，叠氮钠和十二烷基硫酸钠（SDS）等酶抑制剂均可使反应终止。这类终止剂尚能使蓝色维持较长时间（12-24 小时）不褪，是目视判断的良好终止剂。此外，各类酸性终止液则会使蓝色转变成黄色，此时可用特定的波长（450nm）测读吸光值。

6.2 比色
比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪的比色架中。以软板为载体的试验，需先将板置于标准96 孔的座架中，才可进行比色。最好在加底物液显色前，先将软板边缘剪净，这样，此板就可完全平妥坐入座架中。
比色时应先以蒸馏水校零点，测读底物孔（未经任何反应仅加底物液的孔）和空白孔（以生理盐水或稀释液代替标本作全过程的孔），以记录本次试验的试剂状况。其后可用空白孔以蒸馏水校零点，以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度，然后进行计算。
比色结果的表达以往通用光密度（oplical density，OD），现按规定用吸光度（absorbence，A），两者含义相同。通常的表示方法是，将吸收波长写于A 字母的右下角，如OPD 的吸收波长为492nm，表示方法为"A492nm"或"OD492nm" 。

6.3 酶标比色仪
酶标比色仪简称酶标仪，通常指专用于测读 ELISA 结果吸光度的光度计。针对固相载体形式的不同，各有特制的适用于板、珠和小试管的设计。许多试剂公司配套供应酶标仪。酶标仪的主要性能指标有：测读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范围、线性等等。优良的酶标仪的读数一般可精确到0.0 01，准确性为±1%，重复性达0.5%。举例说，若某孔测得的A 值为1.083，则该孔相对于空气的真实A 值应为1.083± 0.01(1.073~1.093 ），重复测定数次，其A 值均应1.083±0.05（1.078~1.088 ）在之间。酶标仪的可测范围视各酶标仪的性能而不同。普通的酶标仪在0.000~2.000，新型号的酶标仪上限拓宽达2.900，甚至更高。超出可测上限的A 值常以"*"或"over"或其它符号表示。应注意可测范围与线性范围的不同，线性范围常小于可测范围，比如某一酶标仪的可测范围为0.000~2.900，而其线性范围仅0.000~2.000，这在定量ELISA 中制作标准曲线时应予注意。
酶标仪不应安置在阳光或强光照射下，操作时室温宜在15~30℃，使用前先预热仪器15-30 分钟，测读结果更稳定。测读 A 值时，要选用产物的敏感吸收峰，如OPD 用492nm 波长。有的酶标仪可用双波长式测读，即每孔先后测读两次，第一次在最适波长（W1），第二次在不敏感波长（W2），两次测定间不移动ELISA 板的位置。例如OPD 用492nm 为W1，630nm 为W 2，最终测得的A 值为两者之差（W1-W2）。双波长式测读可减少由容器上的划痕或指印等造成的光干扰。各种酶标仪性能有所不同，使用中应详细新闻记者说明书。

7 结果判断
7.1 定性测定
定性测定的结果判断是对受检标本中是否含有待测抗原或抗体作出 "有"或"无"的简单回答，分别用" 阳性"、"阴性"表示。"阳性"表示该标本在该测定系统中有反应。"阴性"则为无反应。用定性判断法也可得到半定量结果，即用滴度来表示反应的强度，其实质仍是一个定性试验。在这种半定量测定中，将标本作一系列稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱，这比观察不稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。
在间接法和夹心法 ELSIA 中，阳性孔呈色深于阴性孔。在竞争法ELISA 中则相反，阴性孔呈色深于阳性孔。两类反应的结果判断方法不同，分述于下。
（1）间接法和夹心法
这类反应的定性结果可以用肉眼判断。目视标本也无色或近于无色者判为阴性，显色清晰者为阳性。但在 ELSIA 中，正常人血清反应后常可出现呈色的本底，此本底的深浅因试剂的组成和实验的条件不同而异，因此实验中必须加测阴性对照。阴性对照的组成应为不含受检物的正常血清或类似物。在用肉眼判断结果时，更宜用显色深于阴性对照作为标本阳性的指标。
目视法简捷明了，但颇具主观性。在条件许可下，应该用比色计测定吸光值，这样可以得到客观的数据。先读出标本（ sample，S）、阳性对照（P）、和阴性对照（N）的吸光值，然后进行计算。计算方法有多种，大致可分为阳性判定值法和标本与阴性对照比值法两类。

a．阳性判定值
阳性判定值（cut-off value ）一般为阴性对照A 值加上一个特定的常数，以此作为判断结果阳性或阴性的标准。用此法判断结果要求实验条件十分恒定，试剂的制备必须标准化，阳性和阴性的对照品应符合一定的规格，须配用精密的仪器，并严格按规定操作。阳性判定值公式中的常数是在这特定的系统中通过对大量标本的实验检测而得到的。现举某种检测 HBsAg 的试剂盒为例。试剂盒中的阴性对照品为不含HBsAg 的复钙人血浆，阳性对照品HBsAg 的含量标明为P=9±2ng /ml。每次试验设2 个阳性对照和3 个阴性对照。
测得A 值后，先计算阴性对照A 值的平均数（NC X ）和阳性对照A 值的平均数（PCX），两个平均数的差（P-N）必须大于一个特定的数值（例0.400），试验才有效。3 个阴性对照A 值均应≥0.5×NCX，并≤1.5 ×NCX，如其中之一超出此范围，则弃去，而已另两个阴性对照重新计算NCX；如有两个阴性对照A 值超出以上范围，则该次实验无效。阳性判定值按下式计算：

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