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ELISA 临床质量评价与质量管理

点击： 作者： 来源： 时间： 2007-04-08 　本站论坛

◎样本稀释，目的是为了减少非特异性反应，所以一定要先加稀释液后加样本，特别注意加样后要在微量振荡器上振荡30 秒钟，同时注意防止液体溢出。如后面操作步骤中加二种以上试剂时均需振荡混匀。
◎如用滴瓶滴加试剂应先将滴瓶摇匀并挤去第一滴有气泡的试剂后加样。
温育
◎抗原抗体反应需要在一定温度下（37°C），经过一定的时间才能达到反应的平衡点
◎ELISA 边缘效应是由温育形成的。所以温育一般采用能使反应液温度迅速达到平衡的水浴法。一种放在水浴箱的隔板上，另一种是放在温箱的湿盒里。水要浸至板条的1/3 处，不可将板条叠加放置。
◎边缘效应（2ng/mlHBsAg 一步法三种不同温育法的结果）
洗涤
◎ELISA 是靠洗涤来达到分离结合与未结合抗原抗体复合物及酶标记物的目的，同时洗涤也可将非特异吸附的蛋白质的干扰以及血球、细菌中的酶干扰清除掉。
◎手工洗涤一般采用浸泡方法：1）甩去孔内反应液；
2）用洗涤液过洗一遍（即注满孔后即甩去）；
3）微孔重新注满洗液后浸泡2-3 分钟，间歇摇动；
4）甩去孔内液体，拍板，用纸吸干。
重复以上操作至少5 次。注意各种试剂盒的洗涤液尽量不要混用。
◎洗板机洗板一定要预先把板架放平，使洗板机上的每个放液和吸液纤孔都能一致地插入孔底，将孔内液体全部吸干，同时要设置一定的浸泡时间。如出现机洗后拍板有较多残留液时应再用手工洗2 次以上。关机前要用蒸溜水冲洗管道，避免堵孔。

显色
◎HRP 催化底物的一步呈色反应，同样需要一定的时间和温度，
◎ 一定要按照说明书规定的时间温度（一般为37°C，10-15 分钟）恒定反应后终止
◎或根据临界值质控血清吸光度值达0.2 左右使的时间而恒定反应时间.
酶标仪判读结果
◎显色反应终止后应立刻比色（30 分钟内）。
常见的显色系统有OPD 和TMB 二种，以后者最为常见，而TMB 酸不易终止因此必须尽快比色以免影响结果。OPD 终止后显棕色，测定波长为490nm； TMB 终止后显黄色，测定波长为450nm，二种底物的校正波长均用6 30nm。使用双波长的优点可以消除反应板条上的划痕手印的干扰。同时要注意反应板应用纸吸干后才能置酶标仪中比色，否则吸光度易出现负值或损坏滤光片。
报告方式
◎定性试验国内外为便于统一计算，一律按S/C.O 方式报告，S 为标本A 值，C.O 即Cut Off 值（阳性判定值)
◎夹心法和间接法以S/C.O≥1 为阳性；
竟争法与中和法以S/C.O﹤1 为阳性
◎Cut Off 的计算公式以试剂盒说明书的为准常见的有：
◎A） C.O=2.1×N（当N 不足0.05 时按0.05 计），
◎此公式由P/N>2.1 换算而来，常用于夹心法。
◎B） C.O=0.5×N，从抑止率公式换算而来，
◎常用于竟争，中和法
◎C） C.O=N C（C 为常数），用于间接法。
◎D) C.O=C×P N（C 为常数），用于间接法。此公式最客观，但对生产厂家要求很高，阴阳性对照测定值要基本恒定。
报告方式
定量分析用已知量的标准品作一系列稀释，ELISA 测定，绘制标准曲线，结果以绝对量或单位表示。
ELISA 的标准曲线每次都要和待测标本做在同一块板上。
◎现有的ELISA 定量试剂盒标准曲线只有在较窄的浓度范围内成直线，要得到精确的结果实属不易。因此严禁用定性试剂盒做定量分析。
灰区概念
把定量分析的正常值范围引入定性分析建立灰区概念，即将CO 值上下的一段区域定为阳性可疑，需重复实验或换试剂重测以确定其阴阳性，如仍落在灰区范围内则报告（阳性）。
灰区概念对血站系统的献血员筛查尤为重要。
灰区的设置有二种：
1）C.O×（1±CV），
CV 为该试剂的批内CV& nbsp; (一般在15-20%间）；
2）C.O±2s，s 为实验室做室内质控ROC 的s 。
高值钩镰效应（HD-HOOK）
◎在二位点夹心ELISA 中，其剂量反应曲线的高剂量（HIGH DOSE，HD）区段，线性走向不是呈平台状无限后延，而是向下弯曲状，似一只钩子或一把镰刀（HOOK），MILES（197 4）根据此现象写实性地称之为"HD-HOOK" 效应。产生该现象的分子机理有"分子变构说"和"浓度效应"等推论。
◎一步法和二步法均存在，只是前者出现的更早些，大多数是高值低吸光度，很少阴性结果。
质量控制（Quality Control，QC）
◎英国 Whitehead 教授建议生化检验工作的质量控制分为4 个步骤：最佳条件的变异（OCV）；常规条件的变异（RCV）；病人结果的统计（SPR）；室间质量控制（EQA）。前三个步骤即室内质量控制（IQC）。
◎在GLP 概念里QC 即指IQC，其定义为：由实验室工作人员采取一定的方法和步骤，连续评价本室工作的可靠性，旨在监测和控制本室常规工作的精密度，提高批内批间样本检验的一致性，以确定检验报告是否可靠或可否发出的一项工作。
◎免疫测定方法的灵敏度和特异性要比生化方法高得多，因此QC 手段不能照搬生化模式。分为定性和定量二个方面。

质量控制（Quality Control，QC）
定性试验：ELISA 定性试验的临床意义在于是否检出病原体，与检出量无关，因此QC 要保证试验的灵敏度和特异性。生化的质控图方法仅能观察灵敏度而无法监控特异性。
建议使用临界值血清界定法：将试剂盒所设的阴阳性对照作为内对照指示反应；另设临界值、高值质控血清，正常人血清作为外对照，与标本同时检测，临界值S/C.O≥1，高值质控血清 S/C.O≥10，正常人血清A 值在0.05~0.07 之间。
◎阳性质控血清失控（临界值为灵敏度，高值为"HOOK" 效应监控）应重做阴性标本；阴性对照失控应重做阳性标本。
◎以表格式记录每块板的外对照实验结果，作为QC 资料存档。
质量控制(Quality Control)
◎定量试验： ELISA 定量试验常见于肿瘤因子（如AFP，CEA，CA 系列），激素类，免疫球蛋白类，这些物质在体内有一定的量（正常范围），超出这个量才呈病理情况，故需定量测定。定量试验的质控方法可参考生化方式。
质量控制(Quality Control)
"即刻性"质控：在开始进行质控时，只需要有3 个质控血清测定值即可进行质控。当这组数据扩大到20 次有效值时就可以计算RCV 的X，s。方法：
（1）先将测定值从小到大排列，X1 最小，Xn 最大；
◎（2）计算X 和s；
◎（3）计算SI 上限值和下限值。
◎SI 上=（X 最小-X）/S， SI 下=（X 最大-X）/S

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