免疫组化染色技术的分类
免疫荧光法（Immunofluorescence technique）
免疫酶法（Immunoperoxidase technique）
免疫金银法（（Immunogold technique）
ABC法（ Avidin-Biotin Complex）
五 蛋白质与蛋白质相互作用的研究技术
1 GST融合蛋白进行Pulldow实验
（1）原理
细菌表达的谷胱甘肽s－转移酶（GST）融合蛋白主要用于蛋白的亲和纯化，也可以将GST融合蛋白作为探针，与溶液中的特异性搭档蛋白结合，然后根据谷胱甘肽琼脂糖球珠能够沉淀GST融合蛋白的能力来确定相互作用的蛋白。一般在得到目标蛋白的抗体前，或发现抗体干扰蛋白质－蛋白质之间的相互作用时，可以启用GST沉降技术。该方法只是用于确定体外的相互作用。
两种应用：
1）确定融合（或探针）蛋白与未知（或靶）蛋白间的新的相互作用
2）证实探针蛋白与已知蛋白质间可疑的相互作用
（2）方法：
1） GST融合蛋白先与下列蛋白溶液之一孵育（a, 单一明确的重组蛋白；b，细胞裂解蛋白混合液；c, 体外翻译cDNA表达得到的未知蛋白）
2）混合液与谷胱甘肽琼脂糖球珠反应 4ºC 2h
3）离心弃上清
4）沉淀加入2× 蛋白Loading Buffer煮沸，离心
5）取上清进行SDS-PAGE电泳，
6）考马氏亮兰染色观察特异沉降的蛋白带，进一步做质谱分析确 定沉降的蛋白；电泳后的胶也可以做Western Blot来确定沉降的蛋白中是否有目的蛋白
该实验设立GST对照，反应均在4ºC进行
2 免疫共沉淀
（1）原理
当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。
如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。
这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合，也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档
缺点：可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用
免疫共沉淀检测蛋白质的原理和常见问题
（2）方法
1) 收获培养的细胞（1×107－1×108）冷PBS洗涤2次
2）细胞裂解液裂解细胞，冰浴30min
3) 12000rpm 离心 30min
4）收集上清并加入适量抗体，4ºC摇动1h
5）加入ProteinG-Sepharose悬液， 4ºC摇动1h
6）细胞裂解液洗涤ProteinG-Sepharose混合液
7）离心弃上清
8）沉淀加2×蛋白Loading Buffer煮沸5－10min
9）离心，上清液跑SDS-PAGE 胶
10）考马氏亮兰染色、银染
Western Blot 质谱分析
（3）注意的问题
1）细胞裂解
采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质
相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。
不能用高浓度的变性剂（0.2％SDS)，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的cocktailer。
2）使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用
3）使用对照抗体：
单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单抗
兔多克隆抗体：正常兔IgG
3 酵母双杂交系统
（1）原理：
将编码某一蛋白X的DNA序列与DNA结合域BD的编码序列融合形成一个杂交体，将编码另一蛋白Y的DNA序列与DNA激活域AD的编码序列融合形成另一个杂交体，当两个杂交体共转化酵母细胞（此酵母细胞上游有DNA结合位点的报告基因），若X和Y没有相互作用，则单独不能激活报告基因的转录；若X和Y可相互作用，则使BD和AD靠近形成一个有效的转录激活子，激活报告基因的转录。因此可通过检测报告基因的转录来研究蛋白质X和Y的相互作用。
1）已知蛋白之间相互作用的检测：
2）蛋白质的功能域研究：通过对其中某一个蛋白质作缺失或定点突变，再用此系统检测是否还存在相互作用，可阐明其功能域或关键氨基酸；
3）克隆新基因和新蛋白：将感兴趣的蛋白质基因与BD基因构建成“诱饵”表达质粒，将某一器官或组织的cDNA文库与AD基因构建成“猎物”基因库，共转化酵母细胞，可筛到与感兴趣蛋白质相互作用的蛋白质的cDNA序列，并推测其蛋白质序列。
4 蛋白质芯片
其制作原理类似于基因芯片，所不同的是，蛋白、多肽芯片所用的样品是提纯的蛋白、多肽。其检测的原理类似于抗原、抗体检测的ELISA法。如采用双抗夹心的形式，可通过机械点涂的方法，将多种不同的单克隆抗体点样固定在固相介质表面，如PVDF膜上，制备成抗体蛋白芯片，与制备的多种抗原样本杂交、结合，芯片上的抗体捕获相应的抗原，然后再与标记的多种不同的抗体杂交，由于抗原具有多价结合表位而结合标记抗体，根据杂交信号的有无、多少而进行定性、定量的分析。
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