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如何正确的进行ELISA测定操作

点击： 作者： 来源： 时间： 2007-04-08 　本站论坛

本文转载自生物秀 www.bbioo.com

　　（2）温育温度的选择。在有的ELISA试剂盒的说明书中，指出温育温度可有两种，例如，一种是37℃下1小时，另一种则为43℃下45分钟。从免疫测定的抗原抗体反应的本质来看，在较低的温度下反应较长的时间最为完全。如2～8℃下反应24小时。较高的反应温度，由于分子运动的加怜惜，反应时间缩短，这一点对分子含量较多的强阳性样本的测定没有问题，但对分子含量少的弱阳性样本则有漏检的可能。因此，我们建议在临床ELISA测定中尽量使用较低温育温度较长反应时间的条件。

　　（3）“边缘效应”的排除。以前在使用96孔板的ELISA测定中，常发现有“边缘效应”，即外周孔显色较中心孔深，产生这种“边缘效应”的原因可能为96孔板周孔与中心孔表面或热力学特征的不同。但有研究证实在温育中的热力学梯度可能是根本原因之所。聚苯乙烯本身为不良热导体，在实验室的常规ELISA测定中，将板从室温（通常在25℃左右）置于37℃温箱，板也升温时，在外周孔与中心孔之间可能存在一热力学梯度。因此使用水浴或在将反应溶液加入至板孔中时，将板和溶液均加热至温育温度（如37℃），就可以很容易地排除“边缘效应”，并且可提高测定的重复性。

　　总而言之，在临床ELISA测定中，要保证好的测定效果，可采用下述简单办法来确保温育条件，即尽量采用水浴，温育中让微孔板浮于水面上，或将浸透水的沙布放入一大饭盒中成一湿盒，放于温箱中，这样就会因为板条孔底部直接与37℃水或湿布的接触，以及水浴箱或湿盒内的高温度，而使反应溶液的温度迅速与温室平衡。

　　五、洗板 本文转载自生物秀 www.bbioo.com

　　固相免疫测定技术是一种非均相免疫测定技术，需以洗涤操作将特异结合于固相的抗原或抗体与反应温育过程中吸附的非特异成份分离开来，以保证ELISA测定的特异性。因此，洗板对于ELISA测定来说，也是极其关键的一步。以HRP作为标记酶的ELISA试剂盒中使用的洗板液一般为含0.05%Tween20的中性PBS，Tween20为一种非离子去垢剂，既含亲水基团，也含疏水基团，其在洗涤中的作用机理是，借助其疏水基团与经疏水性相互作用被动吸附于聚苯乙烯固相上蛋白的疏水基团形成疏水键，从而削弱蛋白与固相的吸附，同时在其亲水基团与液相中水分子的结合作用下，促使蛋白质脱离固相而进入液相，这样就可达到去掉非特异吸附物的目的，但由于抗体或抗原的包被通常也是通过在碱性条件下与固相的疏水性相互作用而被动吸附于固相，因此要注意非离子去垢剂的使用浓度，洗板液中Tween20浓度高于0.2%，可使包被于固相上的抗原或抗体解吸附而影响试验的测定下限。

　　在临床实验室中，ELISA测定的洗板一般有两种方式，即手工和洗板机洗板。手工洗板即是在每次反应温育后，将反应液吸出或甩干，然后在板孔中加满洗液，放置2～3分钟后，将洗液吸出或甩干，再在吸水纸上拍干。重复上述洗涤步骤3～4次，最后在吸水纸上拍干，即可进行下一步测定操作。洗板机洗板则是将上述手工操作改由洗板机进行，使用洗板机洗板的一个特点是，每次洗板后不能拍干，故有较多的液体残留，液体残留量小的洗板机洗板至彻底所需的次数要少于残留量大的洗板机。在特定临床实验室所使用的洗板机，到底洗多少次能达到要求，可进行下面这个简单的实验：选择4×8 HBsAgELISA包被板条，每2×8孔分别加入相同一份弱阳性和一份阴性样本，按试剂盒说明加入酶结合物并完成温育后，洗板孔时按第一排4孔洗1次、第二批4孔洗2次、第3排4孔洗3次——直至第8排4孔洗8次，加底物显色测定，如洗3次后，显色不再改变，即洗3次的板孔比色测定与4次、5次洗板的板孔的吸光度等相同，阳性/阴性值保持最大不变，则可以认定该实验室所用洗板机3次洗板即可达到要求。 本文转载自生物秀 www.bbioo.com

　　六、显色

　　在目前的以HRP作为标记酶的商品ELISA试剂盒中，如以TMB为底物，则提供的底物为A和B两瓶应用液；如以OPD为底物，则试剂盒提供OPD片剂或粉剂，临用前配制。一般商品试剂盒显色反应条件为37℃或室温反应15～30分钟。从理论上说，37℃30分钟才可以使HRP的底物催化反应完全，尽管在最初的10分钟内，绝大部份催化反应即可完成。因此，为使弱阳性样本孔能有充分的显色，建议在37℃下反应25～30分钟后，终止反应比色测定。

　　此外，在加入底物开始显色反应前，最好是先检查一下底物溶液的有效性，即可将A和B两种液各加一滴于清洁的空板孔或eppendorf管中，观察是否有显色出现，如有，则说明底物已变质。以OPD为底物，配好后应为无色，否则就不能使用。以TMB为底物，整个显色反应过程无需避光，而以OPD为底物，则需避光进行。关于TMB和OPD的显色反应特点及注意点可参考前面有关章节内容。显色反应完成后，加入酸终止反应，振荡混匀后即可进行下面的比色测定或肉眼判断结果。

　　七、比色 本文转载自生物秀 www.bbioo.com

　　ELISA的比色测定由酶标仪进行，有的同行可能会认为，既然由酶标仪进行，那么此时便可以万事大吉了，其实不然，因为当代较为先进的酶标仪器仪表，均有较多的功能，使用不当，会得到令人难以理解的结果。如使用酶标仪比色测定后，有许多阴性测定孔的吸光度值为负数或测定假阳性率大大增加等等。这主要是没有正确地理解和使用酶标仪所致。至于如何正确理解和使用酶标仪详见后面有关章节。此处，只是强调下面两点：

　　（1）比色测定时，一定要注意酶标仪的波长是否已调至合适或所用滤光片是否正确。由于有的临床实验室在进行ELISA测定时，以TMB为底物和以OPD为底物的试剂盒均有使用，而前者比色波长为450nm，后者为492nm，滤光片需根据要求随时更换。因此，容易出现滤光片错用的问题。

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