2.1.2 错误排序的影响。合成肽在制备过程中，如果某些肽序列错误，会导致合成肽特异性改变而产生假阳性。另外，在构建基因工程表达载体时引入的HCV 核苷酸发生相位改变或点突变也会对抗原的特异性产生不利的影响，但由于基因工程技术的不断进步，由工艺原因造成的抗原特异性降低会逐渐被克服。
2.2. 3 抗原纯度对特异性的影响。以HCV 抗原为例，利用大肠杆菌大规模表达后需经破碎细胞、盐析、粒子交换柱等分离纯化步骤才能最后的到一定纯度的HCV 抗原。目前的工艺还不能做到抗原纯度为100％，因此抗原中还混有大肠杆菌的其它杂蛋白，受过大肠杆菌感染的人，血清中的抗大肠杆菌抗体可和这些杂蛋白产生反应而引起假阳性。
2.2 人血清中的正常IgG
人血清中IgG 的浓度对HCV 试剂盒有较大的影响。HCV 试剂盒采用的间接法，酶标抗抗体能与人所有IgG 结合，而IgG 吸附于板孔的能力很强，因此我们采用100 微升样稀加10 微升血清来将其稀释以降低本底。到成人时，据统计学调查，成人的IgG 为12mg/ml，而有些人的IgG 浓度会远远高于此，这部分人的血清经ELISA 反应后往往会显色。
2.3 人血情中异常的IgG
结缔组织病（系统性红斑狼疮、多发性骨髓瘤等）等病症时，血清中的风湿小体和其它异常IgG（IgG 浓度达到50mg/ml）会引起本底升高或假阳性。
2.4 溶血的影响
当溶血时，红细胞中的血红蛋白释放到血清中，血红蛋白具有过氧化物酶的性质，当其通过吸附或“PP 效应”（蛋白质间相互吸附的现象）结合后，可催化A、B 液显色而造成假阳性。
2.5 操作不当引起
任何操作不当都会影响结果，因此在操作过程中保证操作的规范，严格按照说明书进行是得到准确结果的关键核基础。
2.5.1 加样
2.5.1.1 样品稀释液少加，或血清多加，都会引起本底增高。对于间接法来说，受上述两个因素影响更大。因为血清中受检的特异性IgG 只占总IgG 中的一小部分。IgG 的吸附性很强，非特异IgG 可直接吸附到固相载体上，有时也可吸附到包被抗原的表面。这些非特异的IgG均可以和酶标二抗发生反应而造成较高阴性本底或假阳性。如果加入的血清过多，高于规定的稀释倍数，必将带来阴性高值。
2.5.1.2 酶结合物的不正确加入。一般来讲，酶也有一定的非特异吸附，将包被好的酶联板再封闭，一方面也可避免酶的非特异性吸附。通常每孔加入的封闭液为120μl。如果加入的酶多于120μl 或加在较高的孔壁上或孔口，也会引起本底升高或假阳性。
2.5.2 温育
5.2.1 由于试剂盒确定的一定温度下的反应时间并不是反应的终点，升高反应的温度，会加快反应，同样增加时间会延长反应，这样得到的反应程度会比试剂盒确定的反应程度多，也会引起阴性高值或假阳性。
5.2.2 由于试剂盒通常设定的反应温度为37 度，在这个温度下放置30 分钟，蒸发的水分会很多，对于整个反应体系来讲，各种反应物的浓度会不断增加，这样必会导致反应最后的值升高。因此温育时应盖上胶贴。
5.2.3 试剂盒在设计时，反应是在静置条件下完成的，如果反应改变为振动条件，会加快分子的热运动，增加反应的机会。
5.2.4 试剂盒的温育过程是在培养箱中进行，这和水浴的条件不一样。水浴可是酶联板迅速升温，但较难将温度控制在较稳定的温度，往往高于37 度，同样会引起高值阴性。
2.5.3.洗板
2.5.3.1 各个厂家使用的洗液配方是不同的，是根据各自试剂的条件配制的，采用不配套的洗液常会得到不正常的反应结果，包括本底过高。本公司的洗液采用独特的洗涤系统不能和其它公司的试剂盒混用。
2.5.3.2 试剂盒中提供的洗液是浓缩的，应该稀释到规定的倍数使用，过多稀释洗液，会影响洗液的效果，而使反应的本底过高。
2.5.3.3 稀释洗液的水应该是新鲜的蒸馏水，电导率小于1.2μs。如果水中含有过多的Ca2 、Mg2 ，这些离子会占用表面活性剂，影响洗涤效果。
2.5.3.4 洗板时，应每孔加满洗液，如果加入的洗液液量不够，对洗涤的效果影响也是很大的。本公司的酶联板板孔为400μl，比别的厂家的板孔大，因此洗了别公司的板后要及时调整液量，以避免加液量不满。
2.5.3.5 洗板的次数不够孔内多余的抗原（抗体）或酶结合物不能彻底去除，也会因此本底升高。
2.5.3.6 洗板的强度和洗板的浸泡时间是密切相关的。洗板机不同，使用的泵不同，液体加入时的冲力不同。如果加入洗液的冲力不大，也没有设定浸泡时间，同样会使结果的A 值偏高。
2.5.3.7 洗板完毕后，要进行拍板，尽量采用质量好的毛巾和吸水纸，使用易掉渣的纸，纸屑会留在板孔中，由于纸屑中含有氧化剂而造成高值阴性。
2.5.4 显色。加A、B 液准确，顺序不能颠倒，要及时终止显色。终止后要在3 分钟内读数，否则强阳性会变低。
2.5.5.枪头、加样槽或其它来源的污染
如果使用的枪头、加样槽是反复使用的，必须肯定其没有来自酶或阳性的污染。酶作为反应的催化剂，及其微量也会很明显影响反应。反复使用的枪头、加样槽清洗不当，也会干扰反应。如将枪头使用84 消毒液浸泡而没有冲洗干净，因为84 是强氧化剂，加入AB 液后就会显色。同样枪头和加样槽不正确清洗，改变加入试剂的PH 值，反应的结果也会不正常。常常有人用手纸将加样槽擦干，但是如果使用的手纸容易掉渣，会将纸上的强氧化剂留在槽中而影响反应。
2.5.6.测A 值时，微孔条底部不透明、带水滴、有划痕及不规则的表面都可能引起A 值的升高。
三、cut off 值附近血清的处理
1.cut off 值附近的值是客观存在的
cutoff 值指经过大量临床调查后自行制定的判断阴阳性的界限。Cut off 值附近的值客观存在基于以下原因：大量临床阴性样本A 值呈正态分布；这些阴性样本A 值是由低到高的连续曲线；cutoff 值是这个连续曲线上的截断值。
1.1 正常血清A 值的正态分布如图一：
当试剂盒研发完成后，需要进行大量的临床样品的考核。其中阴性血清的A 值呈正态分布，大约95％的阴性血清值与平均值相近，而有5％的阴性血清则明显低于或高于平均值，这是cutoff 值可根据95％的置信限来确定。若试剂盒的特异性很好，可用98％作为置信限来确定cutoff 值。但不论是选择多少的置信限，总存在置信限以外的区域，该区域的部分样品A 值会高于cutoff 值，从统计上说是无法避免的。
1.2 正常血清A 值的连续分布
经过大量的临床调查会发现，正常血清的A 值是一条从小到大的连续曲线。如图二：
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