一、实验目的：
通过不同的试验设计方法，对具较高杀虫毒力的苏云金芽孢杆菌WB7菌株进行摇瓶培养基最优化的研究
二、材料与方法
1 实验室培养基筛选
1.1 供试菌株
苏云金杆菌WB7菌株
1.2 培养基
初筛培养基配方组分如下：
1.3 摇瓶培养与计数
将活化菌种接种到新鲜的LB培养基中过夜，再按1%接种量转接于各供试培养基，摇床振荡培养至30%芽孢脱落。培养条件：250ml三角瓶每瓶装量25ml培养基，灭菌前pH7.2，30℃下180 r/min。
培养后菌液在无菌条件下10倍稀释至10-7、10-8、10-9，并将此3个稀释度在无菌条件下，吸取1ml于无菌平板中，每稀释度重复3个平板。将灭菌后冷至不烫手的平板计数培养基倒入平板中（8-10ml），迅速旋转平板，混匀后使培养基铺满整个平板，凝固后倒置平板于30℃培养18小时后取出。统计菌落数，选择稀释梯度中重复性最强者为试验结果。
1.4 溶解性葡萄糖培养基筛选
用BP、TP、PM、T-3四种初筛培养基进行摇瓶培养，稀释平板计数后，筛选出对WB7生长较有利的培养基组合，并以此为基础培养基，采用L27 ( 313 )正交表来安排试验。正交试验的因子与水平见表1。
1.5 碳、氮、磷的影响
将葡萄糖作为碳源，蛋白胨、酵母膏作为氮源，KH2PO4为磷源，应用三因子二次正交旋转组合设计安排试验。各因子的水平编码见表2，组合处理共20个，其中mc=8，mr=6，m0=6。
2 工业培养基筛选
2.1 原料
玉米淀粉、黄豆饼粉、酵母粉、蛋白胨、鱼粉、CaCO
3、KH
2PO
4、MgSO
4·7H
2O（其中黄豆饼粉过100目筛，酵母粉、蛋白胨、鱼粉均过80目筛）。
2.2 采用均匀设计
参照前人经验，取优化所用培养基的各组分的浓度大致范围为：A（玉米淀粉）1.5-6%；B（黄豆饼粉）1-5%；C（蛋白胨）0-0.4%；D（酵母粉）0-2.5%；E（鱼粉）0-2.5%。
将A、B、C、D、E等分后加以调整，形成因素水平表（表3）。为了避免高档水平相遇，调整B、D的水平顺序，将原来的10水平重新定义为1水平，逆时针旋转得到新定的水平序号，根据新的水平，选用均匀设计表U
10（10
8）及其使用表（表4）来安排试验
2.3 采用正交设计
参考均匀设计的结果，采用L27 ( 313 )正交表来安排试验。因子与水平的确定见表5。
表5 L27 ( 313 ) 正交试验因素水平表（%）
|
水平
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玉米淀粉
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黄豆饼粉
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蛋白胨
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酵母粉
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鱼粉
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KH2PO4
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MgSO4·7H2O
|
CaCO3
|
|
1
|
1.5
|
4.5
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0.2
|
0
|
2
|
0.2
|
0
|
0.1
|
|
|
2.5
|
1.5
|
0.4
|
1
|
0
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0.8
|
0.02
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0.5
|
|
3
|
3.5
|
3.0
|
0
|
2
|
1
|
0
|
0.08
|
0
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2.4 摇瓶试验
按照试验设计方案，分别配制不同培养基，250ml三角瓶每瓶装量25ml，灭菌前pH7.5。将活化菌种接种到新鲜的LB培养基中过夜，再按1%接种量转接到不同的培养基中，30℃下180 r/min摇床振荡培养，定时取样涂片染色观察菌体长势及芽孢晶体形成情况，30%芽孢脱落后终止培养。
2.5 计数
将发酵液在无菌条件下10倍稀释至10
-7、10
-8、10
-9，并将此3个稀释度在无菌条件下，吸取1ml于无菌平板中，每稀释度重复3个平板。将灭菌后冷至不烫手的平板计数培养基倒入平板中（8-10ml），迅速旋转平板，混匀后使培养基铺满整个平板，凝固后倒置平板于30℃培养18小时后取出。统计菌落数，选择稀释梯度中重复性最强者为试验结果。
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