| 实验目的：
1．了解病原性球菌的检查程序。
2．掌握细菌涂抹标本制备和革兰氏染色法。
3．掌握病原性球菌的形态和分离培养法。
实验材料：
病原性球菌的形态、脓汁标本、革兰氏染色液、普通平板、血平板、玻片、接种环、酒精灯、光学显微镜、香柏油、吸水纸、擦镜纸、标记笔。
实验内容：
一、病原性球菌的检查程序
病原性球菌常引起化脓性疾病，分离用标本多采用脓、痰液，但也可从分泌物、血液及穿刺液中取材。
1、标本采集
（1）脓液：用无菌棉拭挑取患部深处脓液或分泌物，放入无菌试管内。
（2）痰液：用消毒过的容器收集病人痰液，以无菌棉拭挑取浓稠痰块，放入无菌试管。
（3）咽部分泌物：嘱病人张开口，用压舌板轻压舌根部，以无菌棉拭从鼻咽部位擦拭取材，然后将其放入无菌试管。
（4）血液：高热、败血症患者作血液检样时，最好在发热时，抗菌药物治疗前采取，这时培养阳性率最高。取血3~5毫升，立即以无菌手续注入30~50毫升（使血与培养基之比约等于1∶10）的葡萄糖酚红肉汤增菌培养基中。
（5）脑脊液：对疑患流脑的患者作腰椎穿刺取脑脊液（CSF），脑脊液取出后应盛于无菌容器内，立即送检。
（6）尿道、阴道分泌物：对淋病可疑患者，男性可从尿道取材，取材时应进入尿道1~2cm，如刚排尿，应等待1小时左右。女性则可从宫颈口取分泌物，当插入宫颈口后应稍等片刻，再旋转1~2分钟拿出，取材应立即送检，不可放置冰箱。
2、分离与鉴定
待检标本可直接作涂片染色检查鉴定，必要时可作分离培养及生化反应，致病性鉴定。常见致病性球菌的检查程序如下。
二、涂片染色镜检
（一）涂抹标本制备
方法：
1、涂片：取洁净的载玻片一张，用蜡笔标记，接种环灭菌后，以接种环取浓汁标本1-2环，置于玻片的中央，涂成直径约1cm的均匀薄膜涂片。如用固体培养物，须先加生理盐水，再将细菌少许与生理盐水混匀。
2、干燥：涂片最好在室温下自然干燥，必要时可将涂片膜面向上，小心间断地在弱火高处略烘，以助水分蒸发，但切勿紧靠火焰，以免涂膜烤枯，染色后难以检测。
3、固定：涂片干燥后，手持玻片一端（涂膜面向上）在酒精灯上快速地来回通过三次，共约2~3秒钟，注意温度不可太高，以玻片涂膜的反面触及皮肤觉烫而尚能忍受为度。固定的目的一是杀死细菌；二是使菌体与玻片粘附较牢，在染色时不致被染液和水冲掉；三是使菌体蛋白变性易着色（见图14~2）
（二）革兰氏染色法
革半氏染色法（Gramstain）是丹麦细菌学家革兰（Christain Gram）于1884年发明的，至今已逾百年，但仍在广泛使用，是细菌学中最为经典的染色法。其基本过程是标本经固定后，先用结晶紫初染，再用革兰氏碘液媒染，然后用95%酒精脱色，最后用石炭酸复红稀释液复染。此法可将细菌染成两大类：不被酒精脱色仍保留紫色的为革兰氏阳性菌，被酒精脱色后复染成红色的为革兰氏阴性菌。
1、原理：革兰氏染色法的原理尚不完全清楚，主要有三种学说：
等电学说：革兰氏阳性菌等电点（Ph2~3）比革兰氏阴性菌（Ph4~5）低，一般染色时染液的酸碱度在Ph7.0左右，电离后阳性菌带的负电荷比阴性菌多，因此与带正电荷的结晶紫染料结合牢固，不易脱色。
通透性学说：革兰氏阳性菌细胞壁结构比较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，乙醇不易透入，反而可使细胞壁脱水而形成一道屏障，阻止染料向细胞外渗。革兰氏阴性细菌细胞壁疏松，肽聚糖层很薄，而外膜、脂蛋白、脂多糖均含有大量脂质，易被乙醇溶解，致使细胞壁通透性增高，细胞内的结晶紫-碘复合物容易被乙醇溶解而脱出。
化学学说：革兰氏阳性菌细胞内含有某种特殊化学成分，一般认为是核糖核酸镁盐与多糖的复合物，它和染料-媒染剂复合物相互结合，使已着色的细菌不易脱色。
2、革兰氏染色液的配制：①结晶紫染液：结晶紫14.0g，溶于95%酒精100ml中，制成结晶紫酒精饱和液。取出此饱和液20ml与1%草酸铵水溶液80ml混匀。
②碘液：先将碘化钾2.0溶于约2ml蒸馏水中，再加碘片1.0g，略加振摇，待碘片完全溶解后，再加蒸馏水至总量为300ml。
③稀释石炭酸复红染液：取碱性复红10.0g[或碱性复红（新）4.0g]溶于95%酒精100ml中，配成碱性复红酒精饱和液；取此饱和液10ml与5%石炭酸水溶液90ml混匀，配成石炭酸复红原液；取此原液10ml加入蒸馏水90ml中混匀，即成稀释石炭酸复红染液。
3方法：
①初染：在已固定的细菌涂片上滴加结晶紫染液数滴室温作用一分钟后，用细流水轻轻冲洗。
②媒染：滴加媒染剂碘液数滴，室温作用一分钟，用细流水冲洗。
③脱色：滴加95%酒精数滴，轻轻摇动玻片几秒钟，使均匀脱色，然后斜持玻片，使脱掉的染料随酒精流去，再滴加酒精，直到流下的酒精无色或稍淡紫色为止（约需30s），立即用细流水将酒精冲掉。
④复染：滴加稀释石炭酸复红液复染约30秒钟后用细流水冲洗。
⑤镜检：标本染色后，凉干，滴香柏油，用油镜观察，革兰氏阳性菌染成紫色，革兰氏阴性菌染成红色。
三、平板划线接种法（分离培养法）见细菌分离与培养。
上一篇：肠道杆菌的鉴定 下一篇：固定化酿酒酵母细胞的酒精发酵 | 
