实验报告：
1. 观察示教片并绘图。
2．记录肠道杆菌的分离鉴定程序。
3. 记录肥达氏反应的结果，并判断效价和作出分析。
肠道杆菌的鉴定（二）
实验内容：
1. 观察上次实验结果
在SS平板上的2~3区可看见散在的沿划线分布的大小不同、两种颜色的菌落。
一种是较大的红色菌落，另一种是较小的半透明的淡黄色或无色的菌落。较大的红色菌落是肠道致病菌，较小的半透明的淡黄色或无色菌落是肠道致病菌。详见表8-1。
表8-1 大肠杆菌、痢疾杆菌和伤寒杆菌的生物学特征
2．双糖铁培养基的接种
从SS培养基上挑取较小的无色或淡黄色菌落，可先做革兰氏染色镜检，然后再接种于双糖铁培养基中（为观察比较，同组四人应取大小或颜色不同的两个菌落分别接种于两支双糖铁，并作好标记）。
方法：（即实验五介绍的半固体接种法和斜面接种法的结合）
①用接种针以无菌操作技术挑取标本，立即垂直插入培养基中心至接近管底处，再循原路退出到斜面上；
②接种针自斜面最低处向上划一直线（要求通过试管培养基的中心点），然后再从斜面低处向上轻轻来回作蜿蜒划线；
③接种完毕，盖好试管塞。贴上标签纸。
37℃培养18~24小时，取出观察结果并分析（参照表8-1）
附：双糖铁培养基：蛋白胨20g，牛肉膏3g，酵母膏3g，乳糖10g，葡萄糖1g，氯化钠5g，柠檬酸铁铵0.5g，硫代硫酸钠0.5g，琼脂12~15g，4g/L酚红水溶液6ml，蒸馏水1000ml。除糖类和酚红外，其他各成分均加热溶解，矫正pH至7.4~7.6，再加入糖类和酚红水溶液，混匀，过滤分装，每管3ml，68.95kPa灭菌15min，取出后制成斜面，斜面和底层各占1/2。
3．半固体培养基的接种
另从SS培养基上挑取较小的无色或淡黄色菌落，可先做革兰氏染色镜检,然后再接种于半固体培养基中（为观察比较，同组四人应取大小或颜色不同的两个菌落分别接种于两支半固体培养基，并作好标记）。
方法：详见实验五细菌的分离和培养中的半固体接种法。
肠道杆菌的鉴定（三）
实验内容：
1. 观察双糖铁培养基上细菌的生化反应情况
肠道致病菌： 斜面红色， 底层黄色 ，若形成硫化氢，培养基变黑。
肠道非致病菌： 斜面黄色， 底层黄色，可能有气泡。
原理：培养基的指示剂为酚红，酸性时呈黄色，碱性时呈红色。发酵乳糖的细菌使斜面和底层均呈黄色，可有气泡产生；若只发酵葡萄糖，则因葡萄糖含量少，生成少量的酸可因接触空气而氧化挥发，并因细菌生长繁殖利用含氮物质生成碱性化合物，使斜面呈红色，底层由于缺氧，细菌发酵葡萄糖生成酸类物质不氧化而保持黄色；如细菌分解蛋白质中的胱氨酸产生硫化氢，则与硫酸亚铁作用生成黑色的硫化亚铁沉淀，使培养基变黑。
2.观察半固体培养基上的细菌生长现象
若细菌沿穿刺线生长，穿刺线周围的培养基清晰，则细菌没有动力（即无鞭毛）；若细菌沿穿刺线向周围扩散生长，穿刺线周围的培养基呈云雾状混浊，表明细菌有动力（即有鞭毛）。
结合革兰氏染色结果、SS平板的培养结果、双糖铁培养结果、半固体培养结果作出初步诊断。
3. 血清学鉴定——玻片凝集试验（鉴定菌种）
目的 观察细菌在玻片上与其相应抗体结合所出现的细菌凝集现象，理解抗原抗体反应的特异性。
原理 将已知细菌抗体与待测细菌混合，如果抗原与抗体相对应，则引起细菌凝集，反之则不凝集，据其凝集现象可判断细菌种类。
材料 1、 1：20痢疾杆菌免疫血清，1：20伤寒杆菌免疫血清。
2、 待检菌培养物。
3、 生理盐水、玻片、记号笔、接种环、酒精灯、消毒缸等。
方法 1、 取洁净玻片1张，用记号笔划分三等份，如下图所示：
2、 用接种环分别取生理盐水、1：20伤寒杆菌免疫血清、1：20痢疾杆菌免疫血清各3-4环按图示位置放在玻片上，注意在换取另一种血清时要烧灼接种环，以免混淆血清产生错误结果。
3、 用接种环挑取少量待检菌加入玻片的生理盐水中，充分混匀，再挑取少量待检菌加人1:20伤寒免疫血清中混匀，同法挑取待检菌加入1：20痢疾杆菌免疫血清中，混匀。注意无菌操作。
4、 轻摇动玻片，1—2分钟后观察
结果观察
阳性：液体变清，并有乳白色凝集块出现。
阴性：液体仍然混浊，，无凝集块出现。
记录结果之后，将玻片放入含消毒液的指定容器内，切勿任意放置或冲洗。
注意 取细菌培养物时不宜过多，与免疫血清混合时，必须将细菌涂散、涂均匀，但不宜将面积涂得过大，以免很快干涸而影响结果观察。
4. 细菌代谢产物的观察
观察细菌在培养基中的生长情况，参照前表（肠道杆菌生物学性状）分析并作出初步鉴定，依照此结果，再用其他生化反应来作最后鉴定。
（1）单糖发酵试验：
①原理：各种细菌含有不同的糖（醇）分解酶，分解糖（醇）的能力不同，代谢产物也不同，有的产酸、有的尚有气体形成。因此可协助鉴别细菌，尤其是肠道细菌；
②单糖发酵管的制备：将1.6%的溴甲酚紫水溶液1ml加入PH7.6的蛋白胨水1000ml中摇匀。每200ml为一份，分装到已标好葡、乳、麦、甘、蔗等字样的五个锥形瓶中。在五瓶液体中分别加入五种糖，糖的最终浓度为1%。将五种糖培养基分别装入已备有小倒管的试管中，每管约3~4ml。经68.95kPa高压灭菌15分钟后备用。
③方法与结果：用灭菌接种环分别取大肠杆菌和伤寒杆菌少许，分别接种于五种糖发酵管，经37℃培养18~24小时，观察结果；
ⅰ.糖不分解，指示剂仍为紫色，记录方式（—）；
ⅱ.糖分解（产酸不产气）指示剂变黄，小倒管中无气泡，记录方式（ ）；
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