肠道杆菌是一群寄居于人或动物的肠道内的细菌，多数为非致病菌或条件致病菌，少数为致病菌。其生物学性状相似，但生化反应、抗原构造有差异，据此可将它们分类、鉴定。
实验目的：
1.熟悉肠道杆菌未知标本分离和鉴定方法；
2.掌握肥达式反应的原理及结果分析，熟悉其操作过程；
3.了解大肠杆菌、痢疾杆菌及伤寒杆菌革兰氏染色形态示教片
4.了解肠道杆菌常见的一些生化反应及其在鉴定上意义、
实验材料：
1. 大肠杆菌或痢疾杆菌或伤寒杆菌革兰氏染色形态示教片
2.大肠杆菌、痢疾杆菌（或伤寒杆菌）在SS培养基上的培养物（示教）；
3.大肠杆菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌、副伤寒甲或乙等在双糖铁培养基上的 培养物（示教）；
4.大肠杆菌与痢疾杆菌（或伤寒杆菌）的混合菌液（模拟粪便标本）；
5.痢疾杆菌及伤寒杆菌诊断血清，生理盐水，玻片；
6.诊断用肥达式菌液、肥达式平板、小试管、吸管、无菌滴管、伤寒患者血清（经56℃30分钟灭活）、水浴箱等；
7. 单糖发酵管、蛋白胨水培养基、醋酸铅培养基、葡萄球菌和绿脓杆菌在普通琼脂平板上的培养物。
实验内容：
1．肥达氏反应
①原理：人体感染伤寒杆菌或副伤寒杆菌后，能产生与这些细菌起特异性反应的抗体，这种抗体及其量可以用已知的抗原来测得。本实验用已知的伤寒杆菌H、0抗原和甲型、乙型副伤寒杆菌的H抗原与可疑病人血清做定量凝集试验，可测定患者血清中相应抗体的含量及其增减情况，以协助伤寒或副伤寒病的诊断。
②方法：
ⅰ）取一有20（5*4）孔的有机反应板2块，连续标号，每行分别标号1~10。
ⅱ）取中试管1支，加入3.9ml生理盐水，再换一支吸管，吸取患者血清0.1ml（经56℃30分钟灭活）放入中试管内，吸打混匀；（此时血清稀释度为1：40）。
ⅲ）吸取1：40的血清2ml，在每列的第一孔中各加入0.5ml。
ⅳ）在中试管余下2ml血清中，再加入2ml生理盐水，混匀（血清稀释度为1：80）。然后吸取此1：80的血清2ml，在每列第2管中各加入0.5ml。
ⅴ）按上述倍比稀释，并依次加入各管，直至每行第9管（见表7-1）。
ⅵ）另取吸管1支，吸取生理盐水向每行第10管中各加入0.5ml（对照管）
ⅶ）按10、9、8…1列的顺序，分别对第1行各孔加入0抗原1滴；第2行各孔加入H抗原1滴；同样对第3行各孔加甲型副伤寒（PA）H抗原1滴；第4行各孔加乙型副伤寒（PB）H抗原1滴。由于抗原（菌液）的加入量少，可忽略不计。
ⅷ）将各孔混匀，置37℃水浴箱中2小时，取出置室温过夜，次日观察，判断并分析结果。
③结果观察（见图7-1）：
根据凝集反应的强弱，分别以“ 、 、 、 ”记录：
：液体清澈透明，菌体全部被凝成块，沉于管底。
：液体较透明，大部分菌体被凝集而沉于管底。
：液体稍透明，管底有少量凝集沉淀物。
：液体较混浊，可见极少量凝集物。
-：液体混浊，细菌因重力下降于管底呈边缘光滑圆点（与对照管相似）。
血清效价（或滴度）：能与一定量的抗原发生肉眼可见的明显凝集（即“ ”凝集）的血清最高稀释倍数，称为血清的效价。血清的效价代表着血清中抗体的含量，其效价愈高，所含抗体的量愈多。如血清最低稀释倍数（1∶40）仍无凝集，则视为阴性或效价低于1∶40；如血清的最高稀释倍数（1∶1280）仍完全凝集，则示血清效价高于1∶1280。
④结果分析：
ⅰ）首先应考虑当地正常人效价（正常效价）。一般以单份血清凝集效价：0效价应达1：80以上、H效价应在1：160以上，PA和PB应达1：40以上方有诊断价值；若病程中第2次血清效价比第1次高4倍以上亦有诊断价值。
ⅱ）由于H凝集素在血内保持时间较久，0凝集素较短暂，所以曾接种过伤寒、副伤寒菌苗者，0凝集效价在诊断上较重要。
ⅲ）真正的伤寒病人，0凝集素常较H凝集素出现早、但维持时间较短；H凝集素出现较晚、但效价较高且持续时间较长。
ⅳ）回忆反应：过去曾接种过伤寒、副伤寒菌苗或患过伤寒、副伤寒病，近期又发生感染如流感、肝炎、结核病等，可非特异地产生较高的H凝集素和较低的0凝集素，此现象称为回忆反应。
ⅴ）若0效价高而H不高（对正常效价而言），则可能是感染早期或与伤寒杆菌0抗原有交叉反应的其他沙门菌感染。
ⅵ）确诊为伤寒的患者中，约有10%的患者该试验始终阴性或效价不高，故阴性结果不能排除伤寒的诊断。
ⅶ）采血时间不同，肥达式反应的阳性率也不同。发病第1周约为50%；第2周80%；第4周90%以上。恢复期效价最高，以后逐渐下降，直至转阴。一般以双份血清（急性期和恢复期）对比，效价有明显上升者作为新近感染的指征。
1. 观察大肠杆菌（或痢疾杆菌/伤寒杆菌）革兰氏染色形态示教片
2. 肠道致病菌的分离鉴定（一）
（1）介绍肠道致病菌的分离鉴定程序（图7-2）
（2）分离培养与鉴定具体方法
①取材：挑取黏液脓血样粪便置清洁容器内立即送检。若不能及时送检，应用甘油缓冲盐水保存。若无法获取粪便时，用肛拭子检查（用无菌棉拭子经生理盐水湿润后，插入肛门4~5cm处轻轻沿肛壁擦拭一圈后取出，放入含少量甘油缓冲盐水的无菌试管中送检。
②粪便标本或肛拭子可直接在SS琼脂平板上划线分离培养（常用三区划线法，详见实验五 细菌的分离与培养）。
对血、骨髓、尿等标本可先做增菌培养，然后取增菌培养物在上述平板上划线分离，经37℃培养18~24小时。
2．SS平板分离培养（方法同前）
三区划线时注意：无菌操作; 划线角度准确，轻而快; 分区合理； 接种环适时处理；培养基正确放置，作好标记.。
附. 有关培养基及试剂的配制：
（1）肉汤培养基：新鲜肉浸液1000ml、蛋白胨10mg、氯化钠5g，上述各成分混合后调PH7.2~7.4，分装于100ml疫瓶中，每瓶50ml，高压灭菌后备用。该培养基适合于各类细菌的增菌培养。
（2）SS琼脂平板：牛肉膏5g、蛋白胨5g、乳糖10g、胆盐8.5g、枸橼酸钠8.5g、硫代硫酸钠8.5g、琼脂20g、枸橼酸铁1g、0.1%煌绿溶液0.33ml、1%中性红溶液2.5ml、蒸馏水1000ml。除了煌绿、中性红以外，将其它各成分混合于蒸馏水中，加热溶化，调PH至7.0，再加入煌绿和中性红，分装于三角烧瓶中，以68.95kPa高压灭菌10分钟，待冷至50℃左右，倾注于无菌平板中，冷后备用。适合于粪便标本中肠道致病菌的分离。
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