| 农杆菌的活化培养及介导的遗传转化 | 点击： 作者： 来源： 时间： 1970-01-01 本站论坛
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（4）取出离心管，在超净工作台上弃去上清。向离心管内加入适量无菌MS 液体培养基，悬浮起菌体，转入无菌容器中，用MS 液体培养基稀释至OD600≈0.2 。
4 ．叶盘法转化
（1）取培养6～7 天的甘蓝无菌幼苗，将胚轴剪成5～8mm 长的小段，子叶带子叶柄剪下，转入预培养培养基中，于25℃，光照条件下预培养2 天。
（2）将预培养的材料取出，放在无菌的小培养皿中，保留培养基。
（3）向皿中倒入稀释好的菌液，轻轻摇晃2～3 下，立即取出胚轴切段及子叶，置无菌滤纸上吸去多余菌液。
（4）将子叶及胚轴切段放回到原预培养的培养基中，盖上培养皿盖，用石蜡膜封口，于27℃，黑暗中共培养2 天。
（5）将材料转入到脱菌培养基中，于26℃ ，光照条件下培养6～7 天。
（6）将脱菌培养基中的材料转入筛选培养基中，同样条件下培养。2～3 周有绿芽分化。
（7）将绿芽转入筛选培养基，2 周更换一次新鲜的筛选培养基，筛选培养3～4 代，淘汰白化的及畸型苗
（8）选择形态正常，生长旺盛的抗性绿苗，转入生根培养基中，15 天后可见幼根生成。待根系形成后取出小苗，自来水洗净根上的琼脂，移入珍珠岩与草炭土1 ：1 混合的基质中，于温室中培养。
（9）取生长良好的植株叶片提取DNA ，进行PCR 扩增及Southern 杂交鉴定。
说明：LBA4404 (pRCL27）为双元载体，所含pRCL27 质粒的T－DNA 中有NPT 一l 基因和以CaMV35S 启动子调控的CpTI 基因。由中科院遗传所朱祯实验室构建。
（四）悬浮细胞与农杆菌共培养转化
目的：以悬浮培养的单细胞或细胞团为受体，与农杆菌共培养实现目的基因转化，并通过再生获得转基因植株。
材料：
（1）烟草愈伤组织。
（2）含NPT-Ⅱ基因质粒载体的农杆菌菌株。
（3）悬浮培养液：愈伤组织培养基成分中增加2,4－D 浓度，可至2mg/L；VB1、VB6 浓度可增至10mg/L；烟酸浓度可增至5mg/L，并加入水解酪蛋白1g/L。
操作：
1. 悬浮细胞系的建立
(1) 在150mL 的三角瓶中加入约50mL 的悬浮培养液。
(2) 取生长快，松散的愈伤组织转入悬浮培养液中，24℃、100r/min 振荡培养。
(3) 每隔3 天转入新培养液中继代一次。
2. 农杆菌培养
（1）将农杆菌接种在YEB 液体培养基中，于28℃、200 r/min 振荡培养至OD600 为0.6～0.8。
（2）取20mL 菌液置无菌离心管中，4000r/min 离心5 分钟，收集菌体。
（3）用细胞悬浮培养液重悬菌体，并稀释至OD6000.25 左右，置冰上待用。
（4）另一种做法是取lmL 菌液加入到50～100mL 新鲜的YEB ( pH7.0）或细胞悬浮培养液中
（pH5.8) ，同时加入l000mol/LAS 继续培养至OD6000.25 左右，约4～6 小时，放置冰上待用。
3 ．共培养转化
（1）将农杆菌液置20℃平衡几分钟。
（2）取4mL 处于对数生长期的植物细胞悬浮液放入直径为10cm 的培养皿中。
（3）再加入4mL 平衡好的农杆菌液混匀，于28℃静止培养2 天。
4 ．转化体筛选
（1）将共培养物低速离心（700r/min ) ，弃上清。
（2）加入细胞悬浮培养液洗涤细胞沉淀3 次。
（3）最后用含500ug/mL 羧苄青霉素或头孢霉素及100 ug/mL 卡那霉素的选择细胞悬浮培养液重悬细胞沉淀，于24℃100r/min 条件下进行选择培养。
（4）当出现微小愈伤组织后转入固体选择培养基上进行愈伤组织继代选择培养。
5 ．愈伤组织分化及生根培养：愈伤组织转入附加卡那霉素的固体分化培养基中诱导分化，将分化出的幼苗转入附加卡那霉素的生根培养基中培养。
说明：共培养时不要振荡，培养条件必须有利于细胞旺盛分裂，才能得到较好效果。
（五）原生质体与农杆菌共培养转化
目的：以原生质体为受体细胞，进行农杆菌介导的目的基因转化。
材料：烟草，带目的基因的根癌农杆菌。
试剂 ：
（1）原生质体分离缓冲液：0.07 % MES [ 2 , ( N－吗琳)－乙基磺酸] ，0.07 % CaC12 , 0.11%
NaH2PO4 , 0.5mol/L 甘露醇（pH5.8）。
（2）原生质体分离酶液：l%～2蝜lμlase onozuka R－10（纤维素酶R－10) , 0.1% Macerozyme
R10（果胶酶R10)，溶于原生质体分离缓冲液（pH5.8）。
（3）16 ％蔗糖溶液。
操作：
1．烟草叶肉原生质体制备：
(1) 以12 周龄烟草植株为试材，选取已伸展开的幼嫩叶片按下面程序进行表面消毒：①浸于70％乙醇30 秒，无菌水冲洗1 次。②浸入5％次氯酸钠溶液（其中可加入少许Tween20) 30 分钟，无菌水冲洗3 遍。③浸入1％次氯酸钠溶液10 分钟，无菌水冲洗3 次。
(2) 无菌操作剪碎叶片，放入培养皿中，加入25mL 左右的原生质体分离酶液，于28℃、20～30min 轻摇4～6 小时。
(3) 用倒置显微镜观察原生质体分离情况。
(4) 将分离良好的原生质体悬液，用60～8μm 孔径的滤网过滤，原生质体进入滤液。
(5) 滤液经600r/min 离心5 分钟，原生质体沉于管底，除去上清酶液。
(6) 离心管内加入2mL 原生质体分离缓冲液重悬沉淀，然后在管底缓缓加人16％蔗糖溶液800r/min 离心10 分钟，原生质体漂浮在蔗糖溶液与分离缓冲液中间界面上。
（7）吸取原生质体，用分离缓冲液洗涤，600r/min 离心3 分钟，去上清液。
（8）反复洗涤2～3 次后供转化使用。
２．原生质体预培养：
(1) 用含0.4mol/L 蔗糖的K3 NAA0.1 KT0.2 的液体培养基重悬原生质体，使终浓度为1～2×105/mL。
(2) 将原生质体液体培养基悬液分装于9cm 的培养皿中，每皿5mL 左右，在弱光照（400 lx）下培养至原生质体第一次分裂前。
3. 农杆菌培养：
(1) 将农杆菌接种于YEB 液体培养基中，在27℃、200r/min 条件下振荡培养至OD600为0.5 左右。
(2) 将菌液转入无菌离心管中，5000 r/min 离心5 分钟收集菌体。
(3) 用原生质体液体培养基悬浮、稀释至细胞浓度为1×109 放置冰上待用。
农杆菌培养的另一种做法是经步骤(1)后，取lmL 菌液加入到50～100mL 新鲜的YEB ( pH7.0)或原生质体培养液（pH5.8）中，同时添加入AS100μmol/ L，继续培养至OD600 为0.2 左右时即可直接使用。
4 ．共培养：取5μl 农杆菌加入到盛有原生质体的培养皿中轻轻地混匀，使农杆菌：原生质体约为100 : 1 ，农杆菌终浓度约为107 个细胞／mL 。于室温下共培养2 天。
5 ．脱菌培养：将共培养液转入无菌离心管中，700r/min 离心5 分钟，弃上清。用原生质体培养基轻轻悬浮，再次离心，用含有500ug/mL 的羧苄青霉素的原生质体再生液体培养基悬浮，使细胞浓度约为3～6×10
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