细胞内细胞因子的流式细胞仪检测

② 加入溶血素，室温暗处孵育10分钟。（注意：PMA激活的全血可能会溶血不完全。）

③离心500g 5分钟，弃上清

① 加固定剂，室温暗处孵育15分钟，离心500g 5分钟，弃上清；

② 加破膜剂温暗处孵育10分钟。（剂量参照说明书）

③ 加23mLPBS洗液，离心500g 5分钟，弃上清。

5、细胞内染色

① 加入荧光标记的细胞因子抗体，混匀，室温暗处孵育30分钟。

② 加23mL洗液，离心500g 5分钟，弃上清，加入500LPBS上机或加入500L 1% PFA固定后再上机

七、注意事项

1. 标本处理：避免使用络合钙的抗凝剂，如ACD与EDTA，因为它们会限制钙依赖性激活过程，推荐用肝素钠。此外LPS，一种常见的生物试剂污染物，是强细胞激活剂，可能会混淆试验结果。血样在8小时内分析，超过8小时会导致活性的损失，一般细胞因子阳性细胞会减少5%。如不能在8小时之内检测，应将真空采血管水平室温放置。

2.刺激激活：检测不同的细胞因子根据情况选择不同的刺激剂组合和刺激时间，以保证最佳的检测效果。比如，要检测IFN-γ则可选择PMA和Ionomycin同时刺激；如果用CD4做表面标记，由于多数病人的CD4抗原会因PMA的激活而有不同程度的下调，所以培养时间不能太长，4-6小时为宜，否则CD4下调影响分析

3.选择合适的对照：为保证结合的真是和可靠性，至少荧光设置以下对照：

①未刺激对照：激活时由于BFA的存在抑制了胞内蛋白的转运，因此在激活过程中产生 的抗原与细胞因子会滞留胞内，未刺激对照也应包含BFA。

②