流式细胞术定量检测细胞凋亡的3种方法研究比较

　　凋亡定量检测常需借助流式细胞检查。最早出现且较为常用的流式细胞凋亡定量检测技术是PI染色法。细胞凋亡时DNA断裂成小片段，当细胞用乙醇、TrionX-100处理后，这些小片段从细胞内释放出来，使其DNA含量低于正常细胞的二倍体。用DNA结合染料PI染色后分析，可在G1峰前出现一亚二倍体峰即Ap峰。根据Ap峰的百分率可检测凋亡细胞数。在本组研究中PI法凋亡检出率为27.19%,显著低于TUNEL法及Annexin V/PI法。其检出率低的原因主要是凋亡早期尽管有DNA裂点形成，但尚未出现DNA片段的大量丢失，因此该法不能检出早期凋亡细胞。次要原因是发生于S期或G2 /M期的凋亡细胞，即使有DNA含量降低，其实际含量也不低于二倍体细胞所含的DNA。国内李莉报道采用与本文同一动物模型PI漏检率高达42.8%。此外PI法还存在错检，一部分坏死细胞碎片发生低荧光，位于二倍体峰前，造成PI法错检。据李莉报道错检率达21.3%，因此我们认为PI染色定量检测凋亡并不理想。

　　目前国内外最为常用的凋亡定量检测方法是检测DNA断裂点的TUNEL法。在TDT作用下将FITC-dUTP掺入DNA裂点的3′ -OH端上，根据其掺入量的多少计算凋亡细胞百分比。由于DNA断裂发生在凋亡早期，因此该法可检出早期凋亡细胞，具有较高灵敏性。但该法最大缺点是坏死细胞亦呈现TUNEL反应阳性，使其特异性降低^［3］ 。本研究TUNEL凋亡检出率为50.17%，显著高于其它二法。我们认为这既与其较高的灵敏性有关亦与其较低的特异性有关。为证实此点我们作了进一步研究,结果发现TUNEL凋亡检出率与Annexin V/PI中凋亡＋死亡检出率无显著差异，相关分析亦提示TUNEL凋亡检出率实际更能反映凋亡＋死亡检出率。

　　1992年Fadok 报道在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷酯酰丝氨酸(PS)迁移至细胞外侧^［4］。1995年Vermes利用对PS有高度亲合力的磷脂结合蛋白Annexin V检测凋亡细胞。由于坏死细胞PS亦暴露于外表使Annexin V结合阳性，因此必须同时采用PI这一坏死细胞染色阳性的DNA染料将坏死细胞区分出来。与PI法检测凋亡不同的是该法不需要固定细胞，因此凋亡细胞PI低染。本资料表明使用Annexin V/PI双参数法可将正常细胞、凋亡细胞、死亡细胞区分开来，其凋亡检出率更有特异性。细胞发生凋亡时膜上PS外露早于DNA断裂发生^［2］，因此该法检测早期凋亡优于TUNEL法及PI法。现已明确胸腺细胞可自发发生凋亡^［5］，但本资料对照组PI法未检出凋亡，TUNEL法检出率仅为1.24%，而Annexin V/PI法检出率13.12%,这亦证实该法可检出早期凋亡因而具有更大的灵敏性。该法另一优点是细胞不需要固定，避免了PI法因固定造成的细胞碎片过多及TUNEL法因固定出现的DNA片段丢失。因此更加省时，结果亦更为可靠。

　　综上所述,我们认为Annexin V/PI法既可检测早期凋亡,又可将凋亡及死亡细胞区分开来，较PI、TUNEL具有更高的灵敏性及特异性。且不需固定，省时省力，应是目前流式细胞仪定量检测凋亡的首选方法。

　　作者简介：郑骏年，男，32岁，泌尿外科硕士；

　　指导教师，谢叔良，男，教授，从事肿瘤及移植耐受研究

　　参考文献

　　1　Nicoletti I, Migliorati G, Pagliacci M C. A rapid and simple method for measuring thymocyte apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry . J Immunol Methods， 1991;139:271

　　2　Vermes I, Haanen C, Steffens-Nakken H et al. A novel assay for apoptosis.Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptosis cells using fluorescein labeled Annexin V. J Immunol Methods，1995; 184:39

　　3　Gorczyca W, Gong J P, Darzynkiewicz Z.Detection of DNA strand breaks in individual apoptotic cells by the in situ terminal deoxynucleotidyl transferase and nick translation assay . Cancer Res，1993;53:1945

　　4　Fadok V A, Voelker D R,Campbell P A et al. Exposure of phosphatidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophage . J Immuol， 1992;148:2207