流式细胞术定量检测细胞凋亡的3种方法研究比较

　　1　材料与方法

　　1.1　材料　4周龄雄性昆明小鼠12只。PI(Sigma)。TUNEL试剂盒(德国Boehringer Mannheim)。Annexin V/PI试剂盒(法国国际免疫公司)。流式细胞仪(FACScan型 美国BD公司)。

　　1.2　方法

　　1.2.1　动物模型及细胞制备　10只小鼠腹腔注射地塞米松25 mg/kg，2只小鼠腹腔注射生理盐水作为对照。10 h后取胸腺，网搓法分离胸腺细胞。PBS洗2遍后调细胞浓度2×10⁶ ml^-1，备用。

　　1.2.2　PI染色法　取2×10⁶ 细胞,加入80%冷乙醇，4℃ 30 min，PBS洗1次，加入PI 50 mg/ml，0.1%TritonX-100，0.1 mmol/L EDTA(Na)₂ ，RNase 50 μg/ml。置黑暗处1 h后检测。

　　1.2.3　TUNEL法　取2×10⁶ 细胞，1%多聚甲醛冰上固定15 min,离心去上清,70%冷乙醇固定24 h。然后按试剂盒说明操作。

　　1.2.4　Annexin V/PI法　 取490 μl细胞加入5 μl FITC-Annexin V及5 μl PI(浓度250 μg/ml)，混匀置冰浴暗处温育10 min，PBS洗2遍，上机分析。

　　1.2.5　流式细胞仪分析　 光源为488 nm氩离子激光器，FITC受激发后发绿色荧光，PI发红色荧光,每份标本收集10 000个细胞,然后在Macintosh650计算机上用相关软件分析数据,用HP-Deskjet 1600CM打印机打印结果。

　　2　结果

　　2.1　PI检测法　在正常二倍体细胞DNA峰(G1峰)前出现一亚二倍体凋亡峰,称Ap峰(图1)。

　　2.2　TUNEL检测法　 根据FITC-dUTP掺入量的多少区分正常及凋亡细胞(图2)。

　　2.3　FITC-Annexin V/PI检测法　正常细胞FITC及PI均低染(FITC^- PI^- )，在流式细胞分析图上为R₁ 区细胞簇。凋亡细胞FITC高染而PI低染(FITC PI^- )，图上显示为R₂ 区细胞簇。死亡细胞FITC及PI均高染(FITC PI )，图上显示为R₃ 区细胞簇(图3)。

图1　PI染色法胸腺细胞FACS测定图

　　Fig.1　Cytometric diagram of PI staining of mouse thymocytes

图2　TUNEL法胸腺细胞FACS测定图

　　Fig.2　Flow cytometric diagram of mouse thymocytes using TUNEL assay

　　Note:A peak.normal cells;B peak.apoptotic cells

图3　Annexin V/PI 双参数法胸腺细胞FACS测定图

　　Fig.3　Flow cytometric diagram of Annexin V/PI staining of mouse thymocytes

　　Note:A peak.normal cells;B peak. apoptotic cells necrotic cells;C peak. normal cells apoptotic cells;D peak. necrotic cells;R₁. normal cells;R₂.apoptotic cells;R₃. necrotic cells

　　2.4　PI、Annexin V/PI、TUNEL 3种方法凋亡检出率对照组分别为0、13.12%、1.24%。地塞米松处理组分别为27.19%、32.28%、50.17%,三者之间均有显著差异(P＜0.01),Annexin V/PI法死亡检出率13.25%,其凋亡 死亡检出率为45.62%,与TUNEL法凋亡检出率无显著差异(P＞0.05)。

　　2.5　相关分析发现TUNEL法凋亡检出率与Annexin V/PI法凋亡检出率两者相关系数0.63,P＜0.05，与Annexin V/PI法凋亡＋死亡检出率二者相关系数为0.7,P＜0.05。

　　3　讨论

　　近年来有关凋亡信号转导