细胞支原体污染的PCR检测

支原体菌株来源：M.Arginini ATCC23838 精氨酸支原体,M.FermentaneATCC19989发酵支原体 ,M.SalivariumATCC23064唾液支原体 ,M.HominisATCC23114人型支原体 ,M.OraleATCC23714口腔支原体 ,M.HyorhinisATCC29052猪鼻支原体。其共同引物序列来自16s和23s保守区域，外部引物为Ｆ1 5′-ＡＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＧＣＴＧＧＴＡＡＴ-3′，Ｒ1 5′-ＧＴＴＣＡＴＣＧＡＣＴＴＴＣＡＧＡＣＣＣＡＡＧＧＣＡＴ-3′；内部引物为 Ｆ2 5′-ＧＴＴＣＴＴＴＧＡＡＡＡＣＴＧＡＡＴ-3′，Ｒ2 5′-ＧＣＡＴＣＣＡＣＣＡＡＡＡＡＣＴＣＴ-3′。

ＰＣＲ反应体系和条件：10×缓冲液(10ｍＭＴｒｉｓ-ＨＣｌ、500ｍＭＫＣｌ、20ｍＭＭｇＣｌ2、0.01%明胶)、ＰｒｉｍｅｒＦ1、Ｒ1、Ｆ2、Ｒ2的浓度为2ｎｍｏｌ/μＬ、2.5ｍＭｄ ＮＴＰｓ、Ｔａｑ酶、Ｈ2Ｏ、石蜡油覆盖。反应温度和时间为:94℃/2ｍｉｎ预变性、94℃/30ｓ变性、55℃/1ｍｉｎ退火、72℃/1ｍｉｎ延伸,循环30次后72℃延伸5ｍｉｎ。第1次ＰＣＲ反应取模板10μＬ,第2次ＰＣＲ反应以第1次ＰＣＲ扩增产物为模板取1μＬ。

下面有更详细的：

污染测试--支原体 : PCR方法
原理：
利用具特殊专一性之primers，经由PCR反应来复制mycoplasma DNA。所用之primers来自mycoplasma之conserved 16S-23S rRNA序列，由于此段spacer之序列依mycoplsma种类不同而不同，因此可依所复制之DNA大小及其restriction fragment大小差异来作侦测与鉴定。
特点：灵敏(e.g. 0.1~1.6 CFU / 5 ul sample) 与快速(一天)。可侦测不易培养之mycoplasma (e.g. M. hyorhinis)。不需培养mycoplasma作为正反应对照组，避免可能之污染。
缺点︰PCR反应很灵敏，易有伪阳性结果。此方法尚在评估中，故结果仅作为参考和内部品管之一部份。
材料与设备：
ATCC mycoplasma detection kit:可作50～100 reactions.
提供1st stage primer mixture与2nd stage primer mixture
positive control DNA (A. laidlawii ; M. pirum)
PCR reagents :
Taq polymerase ( 5 U / ul )
dNTP( dGTP, dCTP, dTTP, dATP, 1.25 mM each )
10x PCR buffer (with 1.5mM MgCl2)
25mM MgCl2
sterile ddH2O
Machine / Equipment：
PCR thermal cycler
agarose电泳设备
DNA电泳胶体观察设备
无菌PCR反应管
无菌1.5 ml微量离心管
无菌2ul, 20ul, 200ul, 1000ul Tips/ Pipetmans
方法：
此PCR反应是一种nested PCR，包括2阶段PCR反应，1st stage PCR结束后，取其反应物作2nd stage PCR，然后取2nd PCR产物作agarose gel electrophoresis，依DNA band之有无及片段大小来分析结果。
结果：使用UV light观察，并照相记录。

不过应用较多还是巢式PCR

方法：
此PCR反应是一种nested PCR，包括2阶段PCR反应，1st stage PCR结束后，取其反应物作2nd stage PCR，然后取2nd PCR产物作agarose gel electrophoresis，依DNA band之有无及片段大小来分析结果。
结果：使用UV light观察，并照相记录。

方法再详尽点:

3.1 1st stage PCR reaction（total volume 25 ul）：
3.1.1 测试样品 ( 2 ul / each )
3.1.1.1 直接取样测试细胞之培养液。
3.1.1.2 Positive control : mycoplasma DNA ( A. laidlawii ; M. pirum )
3.1.1.3 Negative control : ddH2O
3.1.2 Reaction mixture ( 23 ul / each )
3.1.2.1 10x PCR buffer (含1.5 mM MgCl2 ) 2.5 ul
3.1.2.2 1st stage primer mixture 0.5 ul
3.1.2.3 dNTP ( 1.25 mM each ) 1.0 l
3.1.2.4 MgCl2 ( 25 mM ) 0.5 ul
3.1.2.5 Taq DNA polymerase ( 5 U/ul ) 0.1 ul
3.1.2.6 ddH2O 18.4 ul
3.1.3 PCR program ( 1st PCR与2 nd PCR相同)：使用PCR thermal cycler
3.1.3.1 step 1 : denaturation: 94 ℃ 30 sec
3.1.3.2 step 2 : denaturation: 94 ℃ 30 sec
3.1.3.3 step 3 : annealing: 55 ℃ 2 min
3.1.3.4 step 4 : extension: 72 ℃ 2 min
3.1.3.5 重复3.1.3.2至3.1.3.4步骤30 cycles
3.1.3.6 step 5 : final extension 72 ℃ 5 min
3.2 2 nd stage PCR reaction（total volume 25 ul）
3.2.1 测试样品：1st stage PCR product（1 ul / each）。
3.2.2 Reaction mixture ( 24 ul / each )
3.3.2.1 10x PCR buffer (含1.5 mM MgCl2 ) 2.5 ul
3.3.2.2 2 nd stage primer mixture 0.5 ul
3.3.2.3 dNTP ( 1.25 mM each ) 1.0 ul
3.3.2.4 MgCl2 ( 25 mM ) 0.5 ul
3.3.2.5 Taq DNA polymerase ( 5U/ul ) 0.1 ul
3.3.2.6 ddH2O 19.4 ul
3.2.3 PCR program同3.1.3；使用PCR thermal cycler

4.0 胶片电泳分析
4.1 胶片 (2.0%) 置备: 将2 g agarose溶于100 ml ( 1x ) TAE buffer。
4.2 电泳液：(1x) TAE buffer（Tris-acetate/EDTA electropheresis buffer）
4.3 选择100~500 bp DNA size Marker：取100 bp ladder Marker 5 ul ( 25 ng/ul )
4.4 取10 ul 2 nd stage PCR产物分析，各加入2 ul ( 6x ) loading dye。
4.5 进行电泳分离100V, 25 min。
4.6 胶片染色：ethidium bromide染色10 min，H2O退染10mim。（EtBr为致癌物质，请戴手套并小心操作）
4.7 结果：使用UV light观察，并照相记录。

Figure 1 : Agarose gel electrophoresis of the 2nd -stage PCR Products from eight commonly encountered Mycoplasma and A. laidlawii Species. ( from ATCC mycoplasma detection kit)