初代组织块培养：
取新鲜肝脏，先剥除被膜和血管等纤维成分，用刀或剪刀把肝脏剪成1mm3左右的小块，采用帖壁培养法。
初代消化法培养：
1．把肝组织切成2～4立方毫米的小块，用不含钙镁的BSS液洗两次。
2．移入1：1的0.1％胰蛋白酶和0.1％胶原酶（都用无钙镁BSS配置）中，4℃冷消化10～12小时后，通过250微米和64微米尼龙网或不锈钢纱网滤过。
3．收集细胞、BSS液洗1～2次、计数、接种培养。
消化培养肝细胞的另一种方法是灌流法；肝脏灌流需用全肝，以较小动物如小鼠和大鼠为好。
1．无菌解剖动物，取出肝脏，先用BSS洗除血污。
2．取5ml注射器一支，吸取消化液后，把注射器头轻轻插入肝管中，用线绳结扎牢固，以防消化液漏出，轻轻把消化液注入肝管系统，并不时轻揉压肝脏，以便消化液进入肝小叶中；消化液在肝内停留20～30分后，在吸出消化液的同时并轻揉压肝脏，以使肝细胞脱落和消化液吸出。
3．待吸净消化液后，注入离心管中，低速离心分离，用RPMI 1640培养基培养（较其它培养基为好），能获得较纯的肝上皮细胞和获较好的效果。
传代培养：
待细胞生长连接成片后，用BSS洗一二次，加1：1的0.025％胰蛋白酶和0.02％ EDTA混合消化3～5分钟，待细胞回缩，便停止消化，弃掉消化液，用BSS洗一二次，注入营养液，吹打，制成细胞悬液，再接种培养。
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