• 鼠卵细胞的DNA提取

• 点击：    作者：   来源： 日期：2007-12-19    本站论坛

一、试剂：
TNE ：
10mmol/L Tris cL (ph 8.0)
100 mmol/L NaCl
1 mmol/L EDTA
10%的SDS
酚、氯仿、乙醇
二、操作步骤：
（1）收集鼠卵细胞，PBS 漂洗3次；
（2）将细胞悬浮于500 ul的TNE缓冲液中；
（3）加入6 ul20mg/ml蛋白酶K和50ul10%SDS，轻缓摇动；
（4）37℃保存1-4小时；
（5）加入等体积250ul饱和酚和氯仿，轻摇15-20分钟，1200rpm离心5分钟，用大口径吸管转移上清；
（6）用2倍体积的乙醇（室温），轻摇至DNA出现；
（7）12000rpm离心10 min，20ul TE溶解。

个人心得：
1. 卵细胞与一般的培养细胞系明显不同，收集卵细胞后一般都是在显微镜下计数细胞的个数，常常只有几十个或上百个细胞，所以裂解前要尽量少带其它液体。
2. 卵细胞表面的颗粒细胞等要去除干净。消化时用的胰酶或透明酯酸酶要尽量去除。

一、小鼠卵细胞的收集（适用于 昆明小鼠，BALB/c）
1、第一天PM5：30 7.5IU PMSG注射，第三天PM5：30 即48小时后，7.5IUHCG注射，第四天8：30即15小时后，杀鼠取卵子；用0.1%胰酶去处透明带；

二、卵细胞培养有关的培养基：
1、M2和TYH
     M2       TYH  
NaCl     553.4      697.6  
KCl    35.6      35.6  
CaCl2 H2O    25.1      25.1  
KH2PO4    16.2      16.2  
MgSO4 7H2O    29.3      29.3  
NaHCO3    33.6      210.6  
HEPES    500.5        
Lactic acid(Sodium salt)    435.2(60%的溶液0.39ml）        
Pyruvic acid(Sodium salt)    3.6      11  
Glucose    100.2      100.2  
BSA    400      400  
庆大霉素    20000IU(500ul)      20000IU(500ul)  
用去离子水做溶剂，配完要过滤，整个过程要无菌操作。M2和TYH用之前要预温，培养卵时TYH应做成液滴预温2小时

2 、CZB 单位(mg/100ml)
NaCl 447.0
KCl 36.0
CaCl22H2 O 25.0
KH2PO4 16.1
MgSO4 7 H2 O 29.1
NaHCO3 211.1
60%乳酸钠 0.58ml
丙酮酸钠 3.0
BSA 500
青霉素 6.0
链霉素 5.0
1%酚红 100ul4.1
EDTA Na2 4.1