网站地图	本站论坛
高级搜索	收藏本站

热门关键字：　细胞培养　 pcr 　琼脂糖凝胶电泳　质粒DNA的提取　凝胶加样缓冲液　 PCR inventor

	当前位置：试验方案>细胞生物学>细胞基础> 正文

昆虫杆状病毒表达系统研究

点击： 作者： 来源： 时间： 2007-11-10 　本站论坛

4 ．影响外源蛋白表达的因素
   利用杆状病毒昆虫表达系统表达外源基因的理论基础，就是杆状病毒的基因表达与调控，但有关病毒晚期基因高表达和其调控机制目前还不十分清楚。利用多角体基因的启动子表达外源基因，影响表达水平的因素除与病毒本身的因素有关外，还与受感染细胞的种类和生理状况乃至培养基的质量有关。
   4.1．病毒的稳定性
   杆状病毒在细胞中多次传代后，可能引起基因组的变化。最明显的变化就是形成ov的能力降低。由于细胞间不需要ov形成感染，只需通过BV病毒感染即可。多次传代的病毒也可能出现少多角体(few polyhedfin，FP)表型的变化，一般每个感染细胞只含有10个多角体病毒。其中突变病毒多角体的表达水平也有所降低，应用这种突变病毒会对外源基因的表达带来不利。若重组前病毒是变异FP，通过肉眼分辨重组与非重组病毒时，有可能发生假象。另外，长期多次传代的病毒也往往引起表达水平的降低，为避免上述情况的发生，要限制病毒的传代次数，一般控制在2-3代以内。
   4.2．在昆虫细胞内表达与幼虫体内表达
   虽然目前大部分工作是在细胞培养条件下进行的，当需要大量制备某类表达产物时，最好采用昆虫蛹。因为培养昆虫幼虫远比培养细胞简单、便宜，而且在昆虫体内培养可以提高表达量。一般在幼虫体内的淋巴液中，蛋白含量较在细胞培养基中高l0倍以上，例如小鼠IL-3的表达量在淋巴液中较在细胞培养上清中高500倍，可能是细胞培养基中含有的蛋白酶使之降解所致。
   4.3．启动子类型
   在构建转移载体时，使用不同的启动子就需构建相应的同源序列。目前最常用的启动子有晚期Polh(polyhedrin)启动子和P10启动子，还有碱性启动子以及少数早期启动子。同一目的基因在不同启动子控制下，表达水平会有很大差异。研究发现，分泌类蛋白使用PIO启动子或碱性启动子的效果更好。
   4.4．外源基因序列的本身因素
   能在重组杆状病毒有效表达的外源基因5’端及3’端非编码区越短越好，一般长度在3～400个核苷酸以内。影响表达的其他因素包括：密码子的使用情况(是否为昆虫细胞所常用)、mRNA的稳定性及蛋白质的稳定性等。外源基因附近的序列很重要。Kozak分析了数百个真核序列，得出两点结论：首先，启动子下游第1个ATG常作为起始密码子；其次是在 ATG附近的序列并不是随机的。有95％表达的真核基因在ATG前-3位是嘌呤(而且常是A)，+4位是G。如果-3的A或+4的G有1个被嘧啶替代，翻译水平就下降5~l0倍。如果-3位和+4位均被嘧啶所替代，翻译水平就下降20倍。因此，Kozak提出，(GCC)GGC A／GCC AUG G是高等真核基因起始密码附近的保守序列，其中-3处A最为保守。
   4.5．重组病毒基因的表达与调控
   多角体启动子控制的外源基因的表达，紧靠上游的序列对基因的转录调节是最重要的。许多研究表明，当外源基因5 端加有1～58个多角体蛋白的氨基酸序列以融合蛋白形式表达时，效果最好。用高、中与低3种表达的外源基因进行实验的结果表明，保留一部分多角体5’端序列与外源基因以相同的框架相融合，表达水平最高；如果框架不同，那么从距启动子最近的起始码开始翻译，表达产物水平相对偏低。
5 ．昆虫杆状病毒系统表达外源基因的新进展
   1 杆状病毒载体及其表达系统进展
      昆虫杆状病毒表达系统进行外源基因表达时，存在的一个问题是筛选带有外源基因的重组病毒的效率较低(最初仅0.1％～1％)，而且产物较难纯化。为此，人们设计了各种方法来改进病毒载体，如 NPV DNA线性化，体外定点酶促重组，以及酵母-昆虫细胞和大肠杆菌-昆虫细胞的穿梭载体的开发等。其中Posse等设计的重组-救活可线性AcNPV病毒载体BacPAK6的重组效率较高，高达80％以上，具有重要的应用价值。该重组技术的基本原理为：先找一个在 AcMNPV基因组中不存在的 Bsu36 I酶切位点，采用体外突变，在多角体基因两侧的非必需基因ORF603基因和必需基因ORF1629基因中各引入一个Bsu36 I位点，然后通过重组将突变了的由ORF603基因、多角体基因启动子控制的半乳糖苷酶基因、ORF1629基因引入AcNPV基因组，获得重组病毒载体BacPAK6。(BacPAK6)DNA经Bsu36 I酶切而破坏了必需基因OBF1629，因而靠自身环化不能成活，必须与携带多角体蛋白基因启动子控制的外源基因和OBF1629基因的转移载体发生重组，病毒才能复制而救活，因此，该法的重组率很高。这一系统现已扩展到了BmNPV表达系统。易咏竹等副通过克隆的家蚕核多角体病毒解螺旋基因DNA，与重组救活可线性化的苜蓿尺蠖核多角体病毒基因工程载体病毒(BacPAK6)DNA在昆虫细胞中发生重组，经累代筛选获得了既可感染家蚕又可感染秋粘虫细胞Sf-21的宿主域扩大的昆虫杆状病毒表达载体(HyBacPAK6)，它与含植酸酶基因的转移载体Pvl1393phy在家蚕细胞中的重组率达90％以上。
      此外，Bac—to．Bac表达系统是效率很高的表达系统，它利用穿梭质粒bacmid在大肠杆菌中高效复制后，再提纯用于转染昆虫细胞，大大缩短了时间。王汉中等根据BactoBac表达系统的基本原理，也构建了一种新颖的棉铃虫单粒包埋核多角体病毒表达系统(HaBac—to—Bac)。该系统中供体质粒pFastPhP10中插入了带有多角体启动子序列的完整的多角体蛋白基因，因而多角体蛋白基因的表达和包涵体的形成也可作为转染成功的重要识别标记等，这是商品化的 AcBac—to．Bac系统所不具备的。
      目前可被应用于昆虫杆状病毒表达系统的细胞系较多，但应用较多的细胞系是秋粘虫s.frugiperda卵巢组织的细胞系sf-9，以及家蚕细胞系。洪华珠等建立了一株高水平表达重组蛋白的昆虫细胞系HNU—Tn.FB1。它是粉纹夜蛾Trichoplusia ni脂肪体的传代细胞系。在辅以 5％胎牛血清的商品无血清培养基 Excell400中，该细胞群体的倍增时间为22.9h，最高密度可达2.2×106／ml，表达由AcMNPV构建的重组p.半乳糖苷酶的水平达(225.5±13.4)IU/ml。该细胞系在表达重组蛋白方面与目前商业上最好的“高五”细胞(BTI．Tn．5B1-4)相当，是一株很有价值的细胞系，具有广阔的应用前景。

上一篇：哺乳动物细胞表达系统下一篇：CHO细胞表达系统与酵母细胞表达系统比较

共4页: 上一页 [1] [2] 3 [4] 下一页