常用的增强子有Rous肉癯病毒基因长末端重复序列和人巨细胞病毒增强子。james等利用糖皮质类周醇诱导的鼠乳房瘤病毒(MMTV)启动子和鼠乳房痛病毒长末端重复序列(MMTV-LTR)，在CHO细胞中表达分泌的碱性磷酸酶，产量为利用常规的SV40和 CMV启动子的10倍，超过0.4mg/ml。
构建杂合的启动子是获得新启动子的一个重要途径，比如由人ubiquitin C启动区序列与 CMV增强子组成的杂合启动子、由SV40早期启动子和人I型T淋巴细胞病毒LTR中的增强子序列(R-U5片段)组成的SR-α启动子的活性均与CMV-IE相当；而由鸡β-肌动蛋白启动子和CMV增强子序列构成的杂合启动子不仅活性比CMV—IE高，而且具有更为广谱的宿主细胞范围。Novagen公司的pBacMam表达系统即是以该杂合启动子驱动目的基因的转录。
另一类杂合启动子是由活性很低的启动子与数个转录激活因子结合位点串联而成，这些位点与转录激活因子的结合受细胞外小分子药物的调控；这类启动子主要用作基因的诱导表达。如 Invitrogen公司的ecdysone诱导表达系统，其负责目的基因转录的启动子是由热休克蛋白启动子核心序列(minimal promotor)和5个E/GRE元件组成；Clontech公司开发的Tet-off系统中的启动子则由CMV启动子的核心序列和7个Tet阻遏蛋白结合位点组成。这些启动子在诱导前后活性可相差4个数量级。
另外，在哺乳动物细胞中已发现存在大量在低氧环境中可诱导转录的基因，如编码红细胞生成素(EPO)转铁蛋 白、血红素加氧酶-1等的基因，它们都有一个共同的顺式作用元件(CGTG )，有利于在5’或3’侧翼区的低氧诱导低氧诱导作用因子-1(HIF-1)和低氧反应增强子(HRE)结合，激活靶基因的转录，在低氧浓度下可使重组蛋白大量表达。据报道红细胞生成素启动子在 1%氧浓度比在21%氧浓度下活陛增强100倍。这又是一种新的提高表达量的作用机制。
2 宿主细胞 哺乳动物细胞表达外源蛋白最初是将抗体基因重新导人淋巴细胞中由病毒(如SV40)或lgG的启动子增强子引导。产生的抗体具有相应的结合能力和数应功能，但表达量很低。
常用的非淋巴细胞类有中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、小仓鼠肾(BHK)细胞、COS细胞、小鼠NSO胸腺瘤细胞和小鼠骨髓瘤SP2/0细胞等。不同宿主细胞表达的重组蛋白其稳定性和蛋白糖基化类型不同，需根据要表达的目的蛋白选择最佳的宿主细胞。
COS细胞是进行外源基因瞬时表达时用途最广的宿主，其重组载件易于组建，便于使用，而且对插入DNA的量或者采用基因组DNA 序列的情况都没有什么限制，便于通过检测表达情况来确证cDNA的阳性克隆，也利于快速分析引入克隆化cDNA序列中的突变。CHO细胞则利于外源基目的稳定整合，易于大规模培养，能在无血清和蛋白的条件下生 比，是用于真核生物基因表达软为成功的宿主细胞。已用于多种复杂的重组蛋白的生产，但其产量较低，一般仅占细胞蛋白的2.5%，而用细菌表达可获得占总蛋白50%的蛋白表达水平，但大肠杆菌表达的动物蛋白能进行正确的翻译后加工如糖基化和三维结构的形成，不具有与天然抗体相似的功能活性，且在人体内易于清除。如果需要表达具有生物学功能的膜蛋白或分泌型蛋白，例如细胞表面的受体或细胞外的激素和酶，则不能在原棱细胞中表达。而哺乳动物细胞表达的蛋白则具有天然蛋白的生物学活性。为提高哺乳动物细胞的蛋白表达量，需选择合适的表达载体和有效的启动子和增强子。
近几年也陆续发现了几种新的有较大应用价值的细胞株：如来源于MadIin-Darby犬肾的高分化内皮细胞株(MDCK)，Pei等用该细胞株表达分泌型的基质金属蛋白酶MMPI3，发现高表达的阳性细胞克隆可占转染细胞的5％~l0％，其中一个克隆的表达量可占细胞上清总蛋白的l5％~20％，在细胞单层贴壁培养情况下表达量达10 ms/L。作者认为如此高的表达量可能与MDCK细胞的特性有关，因为同样的载体在CH0细胞中仅得到低水平的表达。
在球蛋白基因簇上游50kb处发现有一区域在红细胞系的细胞中起调控基因表达的作用，称为位点控制区域(LCR)， LCR可调整附近区域染色体的结构并增强球蛋白的转录活 性。一些外源基因如thy-l和 TK基因与LCR相连后均可在红系细胞中高表达，而且表达水平与载体的插入位点无关，这一特性使得红系细胞颇受关注。MEL—E9是目前常用于重组蛋白表达的红系细胞株，它来源于感染了SSF病毒(spleen focus forming virus)的N小鼠的脾细胞。
对现有细胞株选择性地进行遗传改造是提高重组蛋白表达水平的重要手段。BHK/vl6细胞株是稳定表达单纯疱疹病毒(HSV)VPI6蛋白的BHK细胞，由于VPI6的转录激活作用，载体中的HSV早期启动子在该工程细胞中有很高的活性；已用该细胞株获得了包括人组织纤溶酶原激活剂、生长因子等在内的多种蛋白的高效稳定表达。基于腺病毒EIA蛋白可反式激活CMV启动子，Cockett等建立了稳定表达EIA的CHO细胞株，在该细胞中重组前胶 原酶的产量与CHO细胞相比增加了l2倍；该细胞在多种抗体的表达中亦取得满意的结果。对细胞其它特性的遗传改造，包括细胞生长周期的调控、细胞的抗凋亡能力、细胞贴壁能力、蛋白糖基化的模式及细胞乳酸的合成等方面，亦有相关报道，其实际应用价值有待得到更多实验数据的支持。
3 表达系统
根据目的蛋白表达的时空差异，可将表达系统分为瞬时、稳定和诱导表达系统。瞬时表达系统是指宿主细胞在导入表达载体后不经选择培养，载体DNA随细胞分裂而逐渐丢失，目的蛋白的表达时限短暂；瞬时表达系统的优点是简捷，实验周期短。大规模的瞬时表达技术是 近年来的一个研究热点。已有报道能放大到100 L反应器中生产重组蛋白，产量(分泌型蛋白)可达l~10 mg/L。不过该方法技术条件要求高，如质粒的纯度、转染的效率等。
稳定表达系统是指载体进入宿主细胞并经选择培养，载体DNA稳定存在于细胞内，目的蛋白的表达持久、稳定。由于需抗性选择甚至加压扩增等步骤，稳定表达相对耗时耗力。Geisse等以白血病抑制因子的制备为例，比较了几种不同稳定表达体系在产量及时间上的差异(表 3)，把目的基因定点整合入染色体高活性位点有望能在较短时间内获得高表达细胞株。如通过Cre或Flp重组酶的作用，将带有相应同源臂的目的基因替换出插入在高活性位点的报告基因。Koduri等甚至证实还可直接通过同源重组作用将目的基因插入至已知的高活性位点区(即体细胞打靶技术)。另外，近年来还报道了一些筛选高表达克隆的新方法，如影印法、固相筛选技术等，对缩短实 验时间甚有帮助。
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