| 显微放射自显影就是运用放射性标记化合物掺入生物样品，以及用核乳胶记录生物样品内放射性同位素释放核射线的技术。根据放射性标记化合物的性质和银粒的分布部位与数量可显示生物样品内生物大分子合成的特异性、部位、相对数量及其动态变化。因此放射性自显影技术广泛应用于生物大分子新陈代谢的研究工作。
一、目的与要求
1、了解放射自显影的原理与用途。
2、初步掌握显微放射自显影样品的制备和方法
3、基本学会显微放射自显影样品的观察、记录与分析
4、验证细胞核内DNA与RNA合成的标记
二、原理
同位素在机体内（或细胞）具有相同的代谢途径；掺入生物样品内放射性同位素释放的核射线产生电离作用，使乳胶中的一些银离子发生聚集而形成“影像”；显影后“影像”处的银离子还原呈银原子，定影期间，乳胶内未聚集的银离子被溶解至定影液中，因此生物样品内掺入放射性同位素的部位呈黑色颗粒，简称银粒。并且放射性标记化合物的掺入量、生物样品中核蜕变释放的射线量和银粒数三者之间成正比。
三、实验内容
1、3H－T标记组培细胞DNA的合成。
2、3H－U标记四膜虫RNA的合成。
四、实验步骤
（一）组培细胞DNA合成的显微放射自显影技术
1． 制备放射性3H－T标记的生物样品
（1） 培养细胞：在每个洗净的青霉素瓶中放入一块长方形的盖玻片，加入1ml细胞悬液，置37°C培养细胞。
（2） 标记：当盖玻片50－70％的表面长有细胞时，将实验组的盖玻片转入装有1ml含3H－胸腺嘧啶核苷（3H－T的剂量未1mCi/ml）培养液的青霉素小瓶内。对照组倒掉原培养液后，加入1ml不含3H－T的新培养液。将两组细胞置于37°C恒温箱内继续培养30分钟。
（3） 洗涤：从青霉素小瓶中取出长有细胞的盖玻片，放在冷却的Hank液内洗涤5－8分钟（中间换Hank’s液2次），以洗去玻片及细胞表面吸附的 3H－T。
（4） 固定：将盖玻片放入Carnoy固定液中固定30分钟（中间换液1次）。
（5） 洗涤：在95％、75％的酒精中洗2次，每次3分钟。然后将小玻片放在滤纸上干燥。
（6） 贴片：在干净载玻片的中间偏右处滴上一、二滴中性树胶，将小玻片在无细胞的一面贴附在载片上，置37°C温箱干燥两天。
（7） 编号：在载片近端处贴一小条胶布，根据实验分组，用铅笔在胶布上统一编号。
（8） 涂保护膜：将两张载玻片无细胞的面紧贴在一起，将有细胞的载玻片一端浸入37°C预温的0.5％的明胶液中，缓慢取出，分开两张载片，竖放于切片盒中。或在小玻片旁滴明胶液，用玻璃推子涂保护膜，置37°C干燥。
上述放射性同位素实验操作步骤，应在指定的实验桌上具有放射性防护设施的托盘内进行。
2． 制备乳胶膜
这一过程全部在暗室安全红灯下进行。
（1）融化与稀释乳胶：先在一个刻度离心管内加入1－2ml蒸馏水，然后在暗室安全红灯下加入等量的核IV乳胶，供滴胶制膜法用；或在有机玻璃盒内加3－5ml蒸馏水与等量的核IV乳胶，供浸胶制膜法用。再将盛乳胶的离心管或有机玻璃盒置40°C水浴中保温15分钟，使乳胶融化。中间可用细玻棒或细玻管搅动乳胶两次，使其充分混匀，但切勿产生气泡。
（2）滴胶制膜法：将载玻片置水浴右边的金属板上预热3分钟，用细玻璃棒吸取融化的乳胶，向样品旁的载玻片上滴一滴乳液，用玻璃推子牵引乳胶，使之均匀地覆盖在标本及载玻片上，然后把载玻片平放在水浴左边的金属板上，待数分钟，使乳胶分布均匀，并在暗室内干燥。
（3）浸胶制膜法：将两张载玻片无细胞的面紧贴在一起，将有细胞的一端浸入乳胶内（样品部分的载玻片务必完全浸在乳胶内）缓慢取出，分开两张载玻片，竖放在切片盒内，于暗室内干燥（图4）。
（4）包装：待乳液干燥后，将载玻片放入切片盒内，在盒的一端放一小袋干燥的硅胶（吸水剂），盖好切片盒，盒外用黑纸包裹，写明盒内样品的组别，以及涂胶日期等。
3． 自显影“影像”的形成与显现
（1）“曝光”：将上面包装好的切片盒置4°C的冰箱内存放5－7天。放射性同位素核蜕变时放出的射线对乳胶的电离作用形象地比喻为“曝光”。
（2）显影：在暗室安全红灯下，将曝光的自显影片放入18－20°C的显影液中5－8分钟，其间搅动显影液数次。从显影液中取出自显影片，立即放入停影液中漂洗30秒钟。
（3）定影：将自显影片转移到18－20°C的定影液内定影15分钟，其间搅动定影液数次。将自显影片转入自来水中冲洗30－60分钟，再用蒸馏水浸洗1分钟，然后放在制片屉上干燥。
（4）染色：向自显影样品上加几滴Giemsa染色液，使其覆盖全部样品，染色10－15分钟，然后用蒸馏水洗净染液。
（5）脱水：将自显影片放在37°C下干燥2－3天，或在浓度递增的酒精中脱水。
（6）透明：自显影片经过两个二甲苯染色缸，共透明15分钟。
（7）封片：从二甲苯中取出自显影片，立即擦去多余的二甲苯，将自显影片平放于制片屉上，在样品上加中性树胶，轻轻地盖上盖玻片，注意勿产生气泡。自然干燥后，就制成了显微自显影样品（图5）。
4． －T标记细胞DNA样品的观察和记录3H
（1） 观察：先在中倍镜下观察显微自显影样品的全貌，检查样品各部分的标记状况，有无假象，以及标记细胞的数量。然后在高被镜下观察标记细胞中银颗粒的分布部位与数量。应在细胞核中看到银颗粒，而核仁处几乎无银颗粒。
随机取样品上、下、左、中、右五个视野，计算五个视野中的标记细胞数及细胞总数。或随机水平移动样品，数500－1000个细胞，并计算其中的标记细胞数。按下式计算标记细胞的百分数（或称标记指数）：
标记指数＝标记细胞数/细胞总数´100％
（2） 记录：画出标记细胞与未标记细胞的图。并写明细胞种类，放射性标记化合物的名称、标记液的放射性强度，标记时间，核乳胶名称，曝光时间，显影液名称及显影时间，染液名称等实验条件。
（二）3H－U标记四膜虫RNA的合成
1． 制备3H－U标记四膜虫样品
（1）取培养18－24小时的四膜虫悬液1ml，转移至离心管内。
（2）标记：加入0.1ml3H－U（10mCi/ml），混匀，20－25培养四膜虫10分钟。以1000转/分的转速离心2分钟，把上清液转移至1号废液瓶内。
（3）洗涤：加入1ml蒸馏水，混匀细胞，洗涤5分钟。以1000转/分的转速离心2分钟，将上清液转移至2号废液瓶内。如上再洗涤1－2次。上清液转移至2号废液瓶内。
（4）固定：摇动离心管，悬浮细胞。加入0.5ml，10％福尔马林固定液，固定细胞5分钟，再加入0.5ml固定液，继续固定5分钟，离心后将上清液转入2号废液瓶内。
（5）洗涤：加入1ml蒸馏水，悬浮细胞，洗涤5分钟，离心后再洗涤1次，上清夜转移至2号废料瓶内。
（6）制备细胞悬液：悬浮细胞后加入0.3ml 75%宜春，混匀细胞。
（7）涂片：向载片中央滴加1滴细胞悬液，转动载片，使细胞混匀、散开。
（8）编号：在载片近端处贴一小条胶布，用铅笔编号。
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