细胞介导细胞毒作用检测法：[3H]脱氧胸苷释放法

[³H]脱氧胸苷释放法

1）标记靶细胞

1．用含5％小牛血清的RPMI-1640培养液将靶细胞配成2×10⁶/ml，取10μCi（370kBq）[³H]TdR加到1ml靶细胞中，37℃水浴标记4～6小时，每30分钟摇晃一次。

2．用RPMI-1640培养液洗涤细胞3次，每次400×g 10分钟。用含5％小牛血清的RPMI-1640培养液将细胞浓度调整为1×10⁵/ml备用。

2）[³H]TdR释放实验

1．在96孔圆底细胞培养板中加入标记的靶细胞，每孔加100μl（含1×10⁴细胞）。

2．向各孔加100μl效应细胞，效应细胞与靶细胞比例根据要求而定，通常为5：1～20：1。阴性对照孔不加效应细胞只加100μl RPMI-1640培养液。阳性对照孔中加100μl 1％NP₄₀。每个实验置三个复孔。

3．置37℃ 5％ CO₂的二氧化碳培养箱培养18小时。

4．离心培养板200×g 10分钟，从每孔中吸出150μl上清液。每孔加150μl含1mg/ml胰蛋白酶和10μg/ml DNA酶的Hanks液，在37℃ 5％ CO₂的二氧化碳培养箱中继续培养30分钟。

5．稍振荡后离心沉淀细胞。每孔吸出100μl上清液置液闪瓶中。

6．每孔加100μl 5％三氯醋酸，用多头细胞收集器将细胞收集到玻璃纤维滤纸上，用5％三氯醋酸洗滤纸3次，将滤纸置液闪瓶中。

7．在液闪计数仪上分别测定上清液中细胞中的每分钟放射性活性（cpm值）。上清液cpm×2是死细胞释放的cpm；细胞cpm＋上清液cpm×2代表总cpm。

杀伤活性（％）＝[（上清液cpm×2）/（细胞cpm＋上清液cpm×2）]×100％