细胞介导细胞毒作用检测法：LDH释放法

LDH释放法

1）测定方法

1．用含5％小牛血清的RPMI-1640培养液将靶细胞调整到5×10⁴～2×10⁵/ml，此浓度需根据情况预先标定。

2．在96孔圆底细胞培养板中加入靶细胞，每孔加100μl。3个效应细胞自然释放对照孔不加靶细胞，只加100μl培养液。

3．向各孔加100μl效应细胞，效应细胞与靶细胞的比例根据要求而定，通常为5：1～20：1。自然释放孔不加效应细胞只加100μl培养液，最大释放孔中加100μl 1％ NP₄₀。每个实验置三个复孔。

4．置37℃ 5％ CO₂的二氧化碳培养箱中培养4～6小时。

5．离心培养板200×g 10分钟。每孔吸出150μl上清液，对应加入另一块96孔酶联检测板中。向第二块板每孔依次加20μl 0.4mol/L乳酸溶液、20μl 4mmol/L 2-p-碘苯酯-3-p-氯化硝基苯四唑，20μl反应液（含0.03％ BSA，2.7U/ml硫辛酰胺脱氢酶，4.5mmol/L氢化型辅酶I（NAD^＋），1.2％蔗糖的PBS），室温中放置20分钟。

6．在酶联检测仪上测定各孔的光密度（OD值），检测波长492nm，参考波长650nm。

2）特异性杀伤活性的计算

杀伤活性（％）＝[（OD实验组－OD总自然释放）/（OD最大释放组－OD总自然释放）]×100％