| 杂交瘤细胞的制备
1） 瘤细胞培养（无特殊要求）
骨髓瘤细胞呈悬浮或轻微附着形式生长，如附着性生长的细胞多时，用吸管轻轻吹打或轻轻叩击培养容器即可分离下来。通常要维持细胞于指数生长期（细胞培养时间为15~20小时），每3~5天取细胞0.2~1ml移入到10ml新培养液中，其最大细胞密度不能超过5×105~106/ml。一般使用含有高糖的DMEM培养液，并补加有pH的稳定剂HEPES。
2）免疫小鼠和脾细胞的制备
免疫：取6~8周龄Balb/C雌鼠，基础免疫2周，静脉再加强免疫一次，3~5天后用于融合。
脾细胞制备：
1．引颈处死小鼠，用酒精消毒表体。
2．无菌条件下取出脾脏，剃除结缔组织和脂肪，用5ml无血清培养液冲洗一次。
3．把脾脏置于已消毒的90~100目不锈钢网或尼龙纱网中。
4．在脾中部切开一小口，用注射器芯从一端轻轻压挤，再用无血清培养液冲洗，令细胞通过纱网，收集入平皿中，或用注射器向脾脏内注入3 ml无血清培养液，反复抽吸数次方法获取细胞，再制成细胞悬液亦可。
5．把细胞悬液注入50ml离心管中，加10~20ml培养液，轻轻吹打数次，室温中置5分钟。
6．离心（800~1000转/分）计数，备用。
3）饲细胞的制备：常用小鼠胸腺细胞或小鼠的腹腔细胞
小鼠腹腔细胞制备方法：
1．引颈处死小鼠，用酒精消毒表体。
2．切开腹部皮肤剥向两侧，暴露出腹壁。
3．用无菌7号针头注射器，吸取3ml无血清培养液。
4．用小镊夹起腹壁，注入3ml无血清培养液，用手反复轻轻揉腹壁，再反复抽吸3~5次。
5．收集末次吸得的细胞，注入50ml的离心管中，再加20ml无血清培养液，用吸管漂洗一次。
6．离心，去上清，用含血清培养基调节细胞浓度为2×105/ml，接种入培养板中，24孔板每孔加0.1ml。
4）细胞融合
HAT培养基的制备
[贮备液成分]100×
次黄嘌呤（Hypoxanthine: H） 1.0×10-2 M
胸腺嘧啶核苷（Thymidine: T） 1.6×10-3 M
氨基喋呤（Amiropterin: A） 4.0×10-5 M
[HT贮备液制备]
1．称取136.1 mg H，38.8 mg T。
2．依次溶解在100ml双蒸水中，H难溶，可加温50~80℃促溶。
3．用0.22微米滤膜滤过除菌，每瓶分装2~5ml，-20℃冰箱贮存。
[A贮备液制备]
1．称取17.6mg A到90ml双蒸水中。
2．滴加1M NaOH溶液并不断摇动，直至完全溶解，再滴加等量1M HCl溶液，恢复pH在7.0左右。
3．补足双蒸水至最终体积100ml。
4．0.22微米滤膜滤过除菌，分装，-20℃冰箱贮存。使用时，每100ml培养液（含血清）加1ml HT贮备液和1ml A贮备液。
PEG（诱导剂）的制备（30%~50%）
1．取分子量1000的PEG高压蒸气灭菌（6.8公斤，15分钟）
2．56℃水浴中融化后，37℃水浴中温浴。
3．取无血清培养液37℃水浴中温浴（单独）
4．配40%浓度时，用刻度吸管吸0.4ml PEG和0.6ml无血清培养液混合、37℃水中温育备用。
细胞准备
1．收集骨髓瘤细胞，用无血清培养液洗3次（37℃），计数活力细胞（不少于90%）。
2．收集小鼠脾细胞，用无血清培养液洗3次（37℃），并计细胞数和测定活力细胞。
3．按1：5或1：10混合脾细胞和骨髓瘤细胞后，离心弃去上清，并以消毒滤纸吸净多余上清。
融合
方法一：
1．将1ml 40%的PEG液一滴滴加入到细胞团中，在60秒内加完，同时并不断轻微转动离心管或用手指轻弹离心管。
2．在不断转动离心管中加1ml无血清培养液，60秒钟内加完。
3．于5分钟内慢慢加完20ml无血清培养基。此时细胞对机械损伤非常敏感。
4．离心（800转/分，8分钟），去上清，用完全培养液10ml悬浮，轻轻混匀。
5．取96孔板，每孔加50微升。
6．取等体积细胞悬液，向另一96孔板中加50微升。
7．送入5%CO2温箱中37℃培养，24小时后更换成HAT选择性培养液。
方法二：
1．加0.2ml 43%的PEG于离心管中。
2．用预先消毒的细玻璃针伸入管中轻轻搅动细胞团。
3．室温中置2分钟。
4．加入10ml完全培养液。
5．800转/分离心5分钟。
6．用2倍HAT培养液培养悬浮细胞，取24孔板，每孔中加0.5ml，另96孔板每孔中加0.1ml。
7．5%CO2温箱，37℃，一周后第一次更换培养液，培养板中预先接种有饲养细胞，加2×HAT选择培养液与原等量培养液混合后，即成为1×的HAT培养基。
融合后细胞培养
1．融合后7~10天用HAT培养液变量换液，以后每隔2~3天半量换液一次。
2．两周后可改用HT培养液半量换液，或仍用HAT培养液。
3．2~3周后出现杂交细胞集落，细胞个大，圆且透明。
4．待集落增殖生长至1/3孔时，应进行抗体检测。
克隆化培养
[软琼脂培养]
1．称1g琼脂粉，加入到100ml双蒸水中，高压蒸气灭菌，4℃冰箱保存。
2．使用前，1%的琼脂和2×的DMEM培养液在45℃水浴中分别温浴。
3．二者等体积混合后，立即加入1.5×107小鼠脾细胞，混匀。
4．立即到入平皿中，每平皿（直径10cm）加10ml，室温中置15分钟。
5．另取杂交瘤细胞悬液和0.5%琼脂等体积混合（0.25%琼脂），加2ml到预先铺有底层琼脂的瓶皿内。
6．CO2温箱培养。
7．10~15天后，有细胞集落形成，适时移入24孔培养板中扩大培养。如用琼脂糖，底层浓度为0.6%，上层为0.3%琼脂。
[有限稀释法]
1．制备有饲养细胞底层的细胞培养板。
2．收集细胞、计数阳性培养细胞。
3．细胞悬液调至5~10个细胞/ml。
4．96孔板中每孔加0.1ml。
5．CO2温箱培养一周后，半量换液，继续培养。
6．适时检测每孔培养上清，挑选呈阳性培养孔的细胞继续进行有限稀释，直至确信孔中细胞为单克隆为止。
7．进行扩大培养。
5）抗体的检测
常用方法：免疫荧光试验、放射免疫试验（RIA），酶联免疫吸附试验（ELISA）等。 | 
