酵母遗传学方法2：蛋白质的抽提

酵母蛋白质的抽提

此法抽提的酵母蛋白适用于SDS凝胶电泳和Western印迹分析。

1．从OD₆₀₀＝2的细胞培养物中抽提酵母蛋白质。培养物的一种简单制备方法是将细胞接种到5ml YPD中，过夜培养后获得指数培养物（OD₆₀₀＝0.5～2.0）。

2．在水浴上把OD₆₀₀＝2的细胞培养物转到含有2ml的50mmol/L Tris-HCl(pH7.5)、10mmol/L叠氮化钠溶液的13mm离心管中，用吊篮式医用离心机离心沉淀细胞。

3．用25号针头吸出上清液，再用30μl ESB缓冲液悬浮细胞。

4．快速转入微型离心管，在100℃下保温3分钟，使蛋白酶失活之后，样品存放于－20℃。

5．加入0.1g的0.2mm的玻珠，或装入玻珠直至液体刚好浸没，剧烈振荡混合2分钟。

6．加入70μl ESB缓冲液，稍加振荡，置100℃保温1分钟。

ESB缓冲液（可在4℃贮存数天）：

2％ SDS

80 mmol/L Tris-HCl (pH 6.8)

10% 甘油

1.5％ 二硫基苏糖醇（DTT）

0.1mg/ml 溴酚蓝

7．取5～20μl抽提液上样进行SDS凝胶电泳。

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