常用细胞凋亡检测方法（二）

二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）

　　磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中(图3)。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2 依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。
　　碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。
　　方法
　　1 悬浮细胞的染色：将正常培养和诱导凋亡的悬浮细胞（0.5~1×106）用PBS洗2次，加入100ul Binding Buffer和FITC标记的Annexin-V（20ug/ml）10ul，室温避光30min，再加入PI（50ug/ml）5ul，避光反应5min后，加入400ul Binding Buffer，立即用FACScan进行流式细胞术定量检测（一般不超过1h）， 同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照。
　　2 贴壁培养的细胞染色：先用0.25%的胰酶消化，洗涤、染色和分析同悬浮细胞。
　　3 爬片细胞染色：同上，最后用荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜进行观察。
　　结果 [图4、图5]
　　注意事项
　　1. 整个操作动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞。
　　2. 操作时注意避光，反应完毕后尽快在一小时内检测。 

图4－－

图5－－