(一)原理
凋亡细胞是由于内源性核酸内切酶的激活后,将DNA切割成许多双链DNA片段以及高分子量DNA单链断裂点(缺口),暴露出大量3-羟基末端,如用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)将标记的dUTP进行缺口末端标记,则可原位特异地显示出凋亡细胞。主要应用的是荧光标记法和酶标记法。
(二)荧光标记法
1.材料与试剂 采用德国Boehringer-Mannheim公司In Situ Cell Death Detection 试剂盒,或美国Oncor公司ApopTagTM试剂盒,包括:
⑴生物素标记的-Dutp(Biotin-dUTP)或地高辛标记的-dUTP(Digoxingeningll-dUTP)1nmol/µl
⑵ TdT酶(25U/μl)
⑶ 反应缓冲液
⑷ 洗涤缓冲液
⑸ 异硫氰酸荧光素(FITC)标记的亲合素或链霉亲合素(2.5µg/ml)或抗地高辛抗体(1︰30)
⑹ PI染液(含PI 5µg/ml及无DNA酶活性的RNA酶0.1%)
⑺ PBS缓冲液
⑻ 塑料盖玻片
2.样品
⑴ 悬浮生长培养细胞的甩片或涂片
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