2． 洗片：

0.2×SSC 37℃洗10min；0.2×SSC与0.1M PBS各半洗10min；

 10．3% BSA/0.05M PBS 包被，37℃ 30min.

 11． 滴加抗地高辛-抗血清碱性磷酸酶复合物（以抗体稀释液1:5000稀

 12． 0.05M PBS洗15min×4次; TSM₁ 10min×2次; 新鲜配制TSM₂ 10min×2次。

 13． 显色：在玻片上滴加适量显色液，4℃避光过夜。

 14． 将玻片置于TE中10-30min以终止反应。酒精梯度脱水、二甲苯脱脂，中性树胶封片。

 15．显微镜下观察结果。

 

 

（四）免疫组化和原位杂交双重染色

1．免疫组化：

（1）将切片浸没于100ml甲醇溶液中（含20μl H₂O₂），5min。

（2）0.01M PBS洗3min×3次，加入含0.25% Trion X-100的0.01M PBS，5min。

（3）0.01M PBS洗3min×3次，加入1%BSA包被液，37℃ 30min。

（4）0.01M PBS洗3min×3次，滴加适当稀释的一抗，4℃过夜。阴性对照组除不加一抗外，其余步骤相同。

（5）0.01M PBS洗3min×3次，滴加适当稀释的二抗（辣根过氧化酶标记），室温放置1-2hr。

（6）0.01M PBS洗3min×3次，0.03%DAB/0.02% H₂O₂ 呈色3-5min。（阳性信号呈棕黄色）

（7）用H₂O₂轻轻洗涤切片，以终止反应。

2．原位杂交：

 免疫组化反应结束后，切片即进入原位杂交的第（4）步，直至结束。（原位杂交阳性信号呈兰紫色）。

 

四、注意事项：

 

１．              作为DNA-RNA的杂交，需防RNase的污染。

cDNA探针在杂交时必须变性解链。具体方法是：将探针置100℃加热5min，冰浴骤冷。