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乳腺组织石蜡切片荧光原位杂交技术（FISH）
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来源：dxy 作者：wenchunhong 发布时间：2007-12-19
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如“article_article.htm”，更多的信息你可以在频道模型管理的地方查看。
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材料：乳腺组织石蜡切片
类别：荧光原位杂交
步骤：
预处理程序：
1. 将载玻片浸入2% 3-氨基丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane， Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) 丙酮溶液中5分钟，随后在丙酮及蒸馏水中漂洗，自然干镌夭Ｆ?
2. 从福尔马林固定石蜡包埋的乳腺癌组织中获取多块4微米切片，分别置于以上经氨基烷基硅烷（aminoalkylsilane）处理过的载玻片上。
3. 将组织切片置于65℃下过夜烘烤。
4. 将组织切片浸于二甲苯中室温脱蜡2次，每次10分钟，随后浸入100%乙醇中5分钟。
5. 将组织切片依次室温置于100％乙醇、85％乙醇和70％乙醇中各两分钟复水。将组织切片室温浸入去离子水中3分钟，用无绒纸巾吸取多余的水分。
6. 50℃下用30%[w/v] 酸性亚硫酸钠（sodium bisulfite ）处理组织切片20－30分钟。
7. 于2XSSC溶液中漂洗2次，每次5分钟
8. 取0.4ml蛋白酶K储存液（20mg/ml）溶于40ml 20XSSC(pH 7.0)得到蛋白酶K工作液（200µg/ml）；将组织切片浸泡在蛋白酶K工作液中，37℃下孵育20-30分钟。
9. 组织切片经蛋白酶K消化后，于2XSSC溶液中漂洗2次，每次5分钟。
特别说明：为确保消化充分，可以自然干燥组织切片，将15µl DAPI复染剂滴加于组织切片区域，立即盖上盖玻片。暗处放置10-20分钟后，在荧光显微镜下选用合适的滤片组观察消化情况。如果消化过度，可放弃本次FISH实验，选择新的组织切片重复实验，缩短蛋白酶K消化时间；如果消化不充分，可将组织切片浸泡在2XSSC溶液中帮助脱落盖玻片，盖玻片脱落后，于2XSSC溶液中漂洗2次，每次5分钟，然后将组织切片置于37℃蛋白酶K工作液中继续消化5-20分钟；如果消化适中，可将组织切片浸泡在2XSSC溶液中帮助脱落盖玻片，盖玻片脱落后，于2XSSC溶液中漂洗2次，每次5分钟，继续第9步实验操作。
10. 将组织切片置于0.1M HCl中室温浸泡5-10分钟，于2XSSC溶液中漂洗2次，每次5分钟。
11. 将组织切片玻片依次置于-20℃预冷的70%乙醇、85％乙醇和100％乙醇中各2分钟脱水。
12. 将组织切片室温浸入丙酮溶液中2分钟。
13. 自然干燥玻片。
14. 加热玻片至56℃。
15. 按照FISH操作步骤进行FISH实验。步骤如下：
标本准备及变性
注意：使用前将盛有变性液70%甲酰胺的容器置于73±1℃水浴箱中约30分钟，使溶液达到所需温度。
1将玻片在变性液中浸泡5分钟。
2将玻片依次置于预冷的70％乙醇、85％乙醇和100％乙醇中各3分钟进行梯度脱水。玻片自然干燥后，可置于45-50℃ 烤片机上预热2-5分钟后与探针杂交。
探针混合物准备及变性
1配制探针并混匀
2 73±1℃水浴箱中变性5分钟之后，将该试管置于45-50℃水浴箱中，杂交前取出。
探针与样本杂交
1将10µl变性后的探针混合物滴于玻片杂交区域，立即加盖盖玻片，用橡皮胶封边。
2将玻片置于预热的湿盒中，42℃保温箱中过夜杂交。
玻片洗涤
室温下将50%甲酰胺 / 2 X SSC溶液（A液）倒入三个分别标记为“1”、“2”、“3”的考普林瓶中。使用前将盛有溶液的考普林瓶置于46±1℃水浴箱中至少30分钟，使溶液达到所需温度。
分别将50ml 2 X SSC溶液（B液）和2 X SSC/0.1%NP-40洗液（C液）倒入考普林瓶中，使用前将盛有溶液的考普林瓶置于46±1℃水浴箱中至少30分钟，使溶液达到所需温度。
洗涤程序：
1. 移去盖玻片，立即将玻片置于盛有50%甲酰胺 / 2 X SSC溶液（A液）的瓶“1”中，晃动玻片1-3秒。按此重复另外几张玻片。
2. 5-10分钟后取出玻片。
3. 将玻片置于盛有A液的瓶“2”中，晃动玻片1-3秒，5-10分钟后取出玻片。
4. 将玻片置于盛有A液的瓶“3”中，晃动玻片1-3秒，5-10分钟后取出玻片。
5. 将玻片置于盛有2 X SSC溶液（B液）的瓶中，晃动玻片1-3秒，10分钟后取出玻片。
6. 将玻片置于盛有2 X SSC/0.1%NP-40溶液（C液）的瓶中，晃动玻片1-3秒，5分钟后取出玻片。
7. 将玻片室温浸泡在70％乙醇中，3分钟后取出玻片。
观察
1 暗处自然干燥玻片。
2 将15µl DAPI复染剂滴加于杂交区域位置，立即盖上盖玻片。暗处放置10-20分钟后，在荧光显微镜下选用合适的滤波片组观察玻片。
储存
完成杂交的玻片置于-20℃避光储存。
注意事项：玻片制备十分重要，要尽量薄，这回直接影响最终结果。
针对不同的切片要适当的调整消化时间。
如果玻片的质量能保证还是没有结果，可以试试延长变性时间。
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