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原位杂交实验步骤

点击： 作者： 来源： 时间： 2007-04-04 　本站论坛

RNA聚合酶 2U/μl 2μl
反应体系总体积 20μl

5．  加入上述各试剂后，混匀，简短离心后在37 ℃孵育2h。
6．  加入2μl无RNA酶的DNA酶I(10U／μ1)，37 ℃孵育15 min降解模板DNA。
7．  加入0.2M EDTA(pH 8.0)溶液2μl终止反应。
8．  加入2.5μl的4 M Licl和7.5μl冷的无水乙醇，混匀，-20 ℃放置2h。
9．  12000g下离以 15 min，弃上清，小心地用50 μl冷的70％乙醇洗涤沉淀。
1O．室温下稍干燥，溶于100μ1 DEPC处理过的三蒸水中，混匀分装，-20 ℃下保持备用。

三、原位杂交

3.1冰冻切片与杂交前预处理

1．  将子宫样品从-80 ℃取出，用OCT包埋，在-23 ℃(切片机腔体温度)平衡至少30 min。将包埋好的样品固定在样品头上，切10μm厚的连续组织切片，平铺于涂有多聚赖氨酸(1mg／m1)的玻片上(玻片预先经180 ℃干烤6小时)，保存于-70 ℃冰柜备用。

2．  冰冻切片经室温干燥10 min后，在4％的多聚甲醛-PBS(pH 7.4)固定lOmin。
3．  活跃的DEPC-PBS(未高压的0.1％DEPC-1XPBS溶液)洗2次，每次5 min。
4．  在0.2M的盐酸作用中作用10 min后，重复步骤4)。
5．  在切片上滴加蛋白酶K(0.1μg／m1)，37 ℃孵育15 min，重复步骤4)。
6．  经0.1M TEA(三乙醇胺)作用5min后，再在新配制的0.25％AA／0.1M TEA (乙酸酐／三乙醇胺，pH 8.0)中乙酰化10 min。
(在大多数实验中，步骤4，5，6省略)
7．  5 x SSC中平衡15 min。

3.2杂交

8．  在脱水后的玻片上滴加预杂交液(约100 μl／玻片)，置于放有湿盒液(50％甲酰胺v／v；0.3 M NaCl；1Mm EDTA；10 mM Tris-Cl，pH 8.O)的湿盒中，55～58 ℃下的烘箱中预杂交2 h。

9．  甩掉预杂交液，地高辛标记的反义或正义cRNA探针(浓度1-2ng／μl)经70 ℃变性1O分钟，置冰上1 min，玻片上滴加预杂交液(约60μl／玻片)，覆盖parafilm膜，放湿盒中在48～58 ℃下杂交18-30 h。

3.3杂交后处理

1O．取出玻片，小心去掉Parafilm膜，甩掉杂交液，用52 ℃预热的5×SSC洗30 min。
11．在无DNA的RNA酶A(20μg／ml)溶液中37 ℃下孵育30 min。
12．分别依次用52 ℃预热的2 X SSC，1 X SSC和O.1 X SSC洗2次，每次30 min。

3.4杂交信号检测

13．在缓冲液A(0.1M Tris-HC 1 pH 7.5，0.15M NaC1)中平衡5min。
14．在玻片上滴加碱性磷酸酶的抗地高辛抗体(1：500～1:2000稀释于含0.5％阻断液的缓冲液A中)，室温反应2h。
15．用缓冲液A洗2次，每次15 min。
16．在缓冲液B(0.1M Tris-HCl；0.1M NaCl；0.05M MgCl_2，pH 9.5)中平衡5min。
17．硝基四氮唑蓝(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚氧磷酸盐(BCIP)溶于缓冲液B中，每ml缓冲液B含有4.5μ1 NBT和3.5μ1 BCIP。在玻片上滴加混合染液在湿盒中显色过夜。
18．充分显色后，用EDTA(1 mM EDTA，pH 8.0)洗15 min终止反应。
19．在95％乙醇中洗l h以除去非特异的背景。
20．用蒸馏水洗15 min除去可能存在的结晶体。
21．脱水、透明，用中性树胶封片。
22．充分干燥后在显微镜下观察、照相。

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