用寡核苷酸探针检测组织切片中的RNA原位杂交- 点击： 作者： 来源： 日期：2007-04-04 本站论坛
用寡核苷酸探针检测组织切片中相关的mRNA(靶核苷酸)是较为常见的RNA原位杂交.这是因
为寡核苷酸探针不仅具有能按靶核苷酸序列设计与特定的靶基因结合,而且以核苷酸为原料
通过DNA合成仪合成.寡核苷酸探针方法简便,探针一般较短组织穿透性好,无须进一步纯
化等优点外,而且易于在组织切片内检测靶mRNA的一种理想的原位杂交探针.作者运用生物
素及地高辛标记的寡核苷酸探针,对17例新鲜乳腺癌组织分别作了RNA原位杂交和Northern
杂交.冰冻切片中RNA原位杂交, ER mRNA阳性率64.6 %(11/17),PR mRNA为58.9%(10/17),
而Northern杂交中ER mRNA阳性率为76.5%(13/17),PR mRNA阳性率为64.7%(11/17).上述两种杂交中ER mRNA 阳性,阴性符合率分别为58.7% 和17.7% , PR mRNA为47.1%和 23.5%
.在此基础上作者还对278例乳腺癌分别作了RNA原位杂交和免疫组化对照检测.石蜡切片中RNA原位杂交,ER mRNA,PR mRNA的阳性率分别为67.3%和61.9%,高于同一组织切片中免疫组化的ER 52.9%和PR的41.8%, ER mRNA,PR mRNA的阴性率为32.7%和38.1%,又低于同一组织切片中免疫组化的ER 47.1%和58.2%.ER mRNA与ER的阳性及阴性符合率分别为48.6 %和28.1%,ER mRNA阳性而ER阴性的占18.7%,ER mRNA阴性而ER阳性的仅占4.3%.PR mRNA与PR的阳性及阴性符合率分别为39.6%,35.9%,PR mRNA 阳性的而PR阴性的占22.3%,PR mRNA阴性而PR为阳性的仅占2.2%.经结合临床随访和组织学分级,淋巴结转移等,得到理想结果.现将原位杂交实验流程介绍如下:
(一)组织的前处理
1. 对组织预处理所用的刀具及容器作清洁处理和灭活RNA酶.
2. 将外科或动物实验切取标本切成≤1.2×1.0×0.2cm组织块立即冷冻在液氮内储存,或用
4% 多聚甲醛(用新鲜0.05mol/L PH7.4 PBS配制)或中性福尔马林(ddH2O配制, PH 7.0)
固定,固定时间以24-36小时为宜,避免RNA降减或固定过度.
3. 为获得高杂交信号,冰冻切片应切成10μm, 切片内如含有脂肪组织应在氯仿内孵育5min
,以得到好的切片背景,并干澡切片.石蜡切片厚度为5-7μm,用无RNA酶的防切片脱落的载玻片贴附组织切片.
4. 石蜡切片经二甲苯脱蜡,梯度酒精处理(100%,95%,80%)至水化(ddH20 3×5min).
(二)杂交的预处理
1. 在37℃ 恒温箱内干燥切片后,滴加 5-10μg/ml蛋白酶K,置37℃ 湿盒内孵育30min, ddH20 3×5min 或 4℃75% 酒精漂洗5min中止蛋白酶K活性.
2. 0.25% 醋酸酐10min, 经70℃ 2×SSC漂洗,40℃ 2×SSC各漂洗15min,2×SSC 3min,切片经75-100% 酒精梯度脱水.
注意事项
1. 蛋白酶K能消化和暴露被遮蔽的靶核酸,以增加探针的可结合性.蛋白酶K 浓度过低,不能使靶核酸有效暴露,浓度过高则组织消化过度,也会影响检测结果.蛋白酶K须用蛋白酶K缓冲液配制(0.1mol/L Tris-HCl PH 8.0,50mmol/L EDTA,经高压灭菌后备用),蛋白酶K应新鲜配制,低温冰箱内分装保存.蛋白酶K消化组织切片是原位杂交实验流程中重要环节,蛋白酶K浓度应力求准确无误.
2. 根据组织类型,固定液的种类,固定时间和切片的厚薄的不同,蛋白酶K浓度也存在差异
,选用蛋白酶K最佳消化浓度是原位杂交成功的必要条件,不可省略.
(三)寡核苷酸探针选择和标记
常用的寡核苷酸探针对已知靶RNA序列而设计的.特定序列的单一寡核苷酸探针,能与靶mRN
A区段的部分序列完全或基本相配对,其长度为19-24核苷酸.这类探针多采用对其5'端进行磷酸化实现.探针通常无须纯化,但是较长的寡核苷酸探针,各片段可能受到污染,应通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法将污染的片段除去.
(四
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