| 小分子RNA－－microRNA | 点击： 作者： 来源： 时间： 2007-04-02 本站论坛
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现行的RNA纯化方法包括有机溶剂抽提+乙醇沉淀，或者是采用更加方便快捷的硅胶膜离心柱的方法来纯化RNA。由于硅胶膜离心柱通常只富集较大分子的RNA（200nt以上），小分子RNA往往被淘汰掉，因而不适用于小分子RNA的分离纯化。有机溶剂抽提能够较好的保留小分子RNA，但是后继的沉淀步骤比较费时费力。mirVana miRNA Isolation Kit是采用玻璃纤维滤膜离心柱(glass fiber filter，GFF)，既能够有效富集10mer以上的RNA分子，又能够兼备离心柱快速离心纯化的优点，是一个不错的选择。对于特别稀有的分子，由于需要分离大量RNA而导致高背景而降低灵敏度，还可以进一步富集10mer到200bp的小分子RNA来提高灵敏度。
小分子RNA探针的制备
方法其实很简单：只需要准备目的基因的一小段寡核苷酸序列，3’端另外增加8个和T7启动子互补的碱基，将这段寡核苷酸和T7启动子引物退火，用Klenow大片断补齐得到双链的转录模版，然后用T7 RNA聚合酶、rNTP和标记物混合，体外转录得到标记的小分子RNA探针。这种方法可以快速制备各种标记（同位素、非放射性标记均可）的小于100nt的小分子RNA探针，适用于包括RPAs，Northerns 和原位杂交等各种方法检测小分子核仁RNA( small nuclear RNA,snRNA)，small interfering RNA (siRNA),，micro RNA (miRNA)和 mRNA。非放射性标记的探针还可以用于原位杂交研究miRNA或者mRNA在组织中的分布。
小分子RNA的检测
由于小分子RNA是一类很小的分子，部分小分子RNA表达水平可能很低，因而需要极为灵敏而定量的分析工具。由于其分子很小，用RT-PCR的方法来定量研究非常困难，目前多数研究人员采用Northern Blots——一种技术复杂而费力的方法来检测小分子RNA的存在。传统的Northern Blot的方法是是用探针检测固相支持物（膜）上的目标分子，由于用探针检测液相中的目标分子远比检测固相中的目标更为灵敏，生物通在这里为大家推荐一种基于核酶保护分析方法改进的新方法——将同位素标记好的小分子RNA探针和待检测样品混合杂交，未杂交的RNA和多余的探针用单链核酸酶消化，然后使核酸酶失活，并纯化杂交的RNA分子，最后通过变性胶电泳放射自显影检测结果。这个基于液相杂交的新方法不但操作简单而快速，而且灵敏度极高——可以半定量检测少至10ng总RNA模版中的小分子RNA，或者说，可以检测attomole (10-18 mol)级别的靶目标！灵敏度是Northern Blot的100倍。除此之外，研究人员还可以在同一个样品中同时检测多个小分子RNA和长的RNA模版。应该说，这个灵活巧妙的设计可以为从事小分子RNA实验的研究人员带来不少方便。
总而言之，无论是siRNA, miRNA, snRNA还是其他的小东西，小分子RNA研究的不断深入将帮助我们揭示更多生命的奥秘。
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