肝中RNA的分离与鉴定
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  • 肝中RNA的分离与鉴定

  • 点击:    作者:   来源: 日期:2007-12-06    本站论坛
[原理]

    细胞内的核酸多以核蛋白的形式存在,其中脱氧核糖核蛋白主要存在于细胞核中,核糖核蛋白主要存在于细胞质中。这两类核蛋白在0.14molL氯化钠溶液中的溶解度相差很大。核糖核蛋白在此溶液中具有很高的溶解度、脱氧核糖核蛋白的溶解度却相当低。制成肝匀浆后,用0.14molL氯化钠溶液抽提,可将两种核蛋白分离。分离过程中加入少量柠檬酸钠,可抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的水解作用。  

在含有核糖核蛋白的0.14molL氯化钠溶液中,调节pH4.2,使其达到等点电,核糖核蛋白即从溶液中沉淀出;用热的10%氯化钠溶液抽提核糖核酸,最后用冷乙醇将核糖核酸钠析出,而获得纯化的RNA

DNARNA在波长260nm处有很高的吸收峰值,蛋白质则在280nm处有很高的吸收峰值。利用这个原理,我们测定纯化样品在260nm280nm处的吸光度,可以推算出样品中RNA的浓度,并判断其纯度。用标准样品测得在波长260nm处,1ug/ml RNA钠盐吸光度为0.025,(光程为1cm),即A2601时,样品中RNA浓度为40 ug/ml。纯净的RNA样品A260/A280的比值约为2.0,样品中含有蛋白质或其它杂质,会使A260/A280的比值下降。A260/A280的比值大于1.8基本能达到各种后继实验的要求。

[操作]

(操作过程可参见流程图)

    1.肝匀浆制备:新鲜兔肝,用0.9NaCl洗去血液,除去结缔组织,剪碎,称取4g肝组织,加4m1 0.14mol/L NaCl溶液,匀浆器中研磨,制成肝匀浆。

    2.分离核蛋白:肝匀浆倒入试管中,4000rpm离心5min,上清倒入另一试管中为A管。沉淀加2m1 0.14molL NaCl搅匀后再置匀浆器中研磨,4000rpm离心5min,上清倒入A管,沉淀重复上述操作,上清并入A管,沉淀弃去。

     3A管用10%乙酸调pH4.2,混匀,静置5min4000rpm离心5min,倾去上清,沉淀含核糖核蛋白。

    4A管沉淀中加3m1 10NaCl,搅匀,100℃水浴10min(不断搅拌,防沸溢出),冷却, 4000rpm离心5min,留上清液。

5A管上清液加95%冷乙醇5m1,见乳白色核糖核酸钠沉淀,混匀放置10min4000rpm离心15min,沉淀为纯化RNA

6RNA的溶解:沉淀中加入0.1 mol/L NaOH 4.0ml,搅拌溶解,2000rpm离心10min,上清液则为RNA水解液。

7RNA的测定:用0.1mol/L NaOH 将样品稀释到一定浓度,以0.1mol/L NaOH 调零,测定样品的A260A280,计算出每克肝组织中的RNA含量,并判断纯化RNA的纯度。


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