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植物组织mRNA提取

点击： 作者： 来源： 时间： 2007-10-24 　本站论坛

由于mRNA末端含有多poly(A)+，当总RNA流径oligo(dT)纤维素时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素柱上，在低盐浓度或蒸馏水中，mRNA可被洗下，经过两次oligo(dT) 纤维素柱，可得到较纯的mRNA。
实验步骤：
1、用0.1mol/L NaOH悬浮0.5-1.0g oligo(dT)纤维素。
2、将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱中或装入填有经DEPC处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床体积为0.5-1.0ml，用3倍柱床体积的灭菌水冲洗柱床。
3、用1x柱层析加样缓冲液冲洗柱床，直到流出液的pH值小于8.0。
4、将提取的RNA液于65℃温育5分钟后迅速冷却至室温，加入等体积2x柱层析缓冲液，上样，立即用灭菌试管收集洗出液，当所有RNA溶液进入柱床后，加入1倍柱床体积的1x层析柱加样溶液。
5、测定每一管的OD260，当洗出液中OD为0时，加入2-3倍柱床体积的灭菌洗脱缓冲液，以1/3至1/2柱床体积分管收集洗脱液。
6、测定OD260，合并含有RNA的洗脱组分。
7、加入1/10体积的3M NaAc(pH5.2)， 2.5倍体积的冰冷乙醇，混匀， -20℃30分钟。
8、 4℃下12000g离心15分钟，小心弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀，4℃下12000g离心5分钟。
9、小心弃去上清液，沉淀空气干燥10分钟，或真空干燥10分钟。
10、用少量水溶解RNA液，即可用于cDNA合成（或保存在70%乙醇中并贮存于-70℃）。
注意事项：
1、 mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。
2、 oligo(dT)纤维素柱用后可用0.3mol/l NaOH洗净，然后用层析柱加样缓冲液平衡，并加入0.02%叠氮钠（NaN3)冰箱保存，重复使用。每次用前需用NaOH水层析柱加样缓冲液依次淋洗柱床。

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