| 植物RNA提取中的一些特殊方法 | 点击： 作者： 来源： 时间： 2007-10-24 本站论坛
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银杏等木本裸子植物的RNA提取方法：
银杏、香机等木本裸子植物，酚类和多糖等次生物质含量较多，对RNA的分离和纯化有很大干扰，严重影响了提取RNA的质量和产量，给相关的分子生物学实验的进行带来阻碍。目前，RNA的提取方法很多，采取常规的Trizol试剂盒、SDS等方法不能提取银杏RNA，而Shujun Chang等(1993)的CTAB法，提取RNA质量也较差，降解也十分严重。对其提取步骤进行改进，得到质量较高的银杏RNA样品。
试验试剂：
1、 1M tris:1 2.11g T ris，溶于60m L水中，用浓盐酸调至Ph8 .0，定容至lOO mL.用灭菌的DEPC水溶解。
2、 500m M EDTA:1 8.61g E DTA "H 2O加入80m L水中，搅拌溶解，用NaOH调pH至8.0，定容至100mL。
3、 10 mol/LLiCL: 42.4 gLiCL, 100mL水溶解即可。
4、 提取缓冲液(DEPC水处理):2% CTAB（蛋白质变性剂）.2% PVPK 30（去除多酚类物质）10 0m M Tris-HCL (Ph8.0)25 m M EDTA（金属鳌合剂）2.0 M NaCL（去除多糖和CTAB）配法:2 g CTAB, 2 g PVP, 10 mL 1 mol/L tris, 5mL 500 mM EDTA, 11.7gNaCL,定容到100mL。
5、 亚精胺(提取时加少量)（RNA酶抑制剂）
6、 4%0一疏基乙醇(提取时加)（去除多酚类物质）
7、 氯仿异戊醇(24: 1)（抽提蛋白质）
8、 10 MLiCL（沉淀大分子RNA）
9、 SSTE（溶解RNA）1.0 M NaCL 0. 5%SDS 1m MEDTA(PH8.0) 10 m MTrisHCL(pH8 ）配法:2.9 g NaCL, 0.25 g SDS, 0.5 mL 1 M tris, 100 u L 500 mM EDTA, pH8.0,定容至50 mL。
试验准备：
1、 研钵和玻璃器皿用锡纸包好，200℃以上向温烘烤2小时以上，或180*C 高温烘烤4小时。
2、 塑料制品(枪头和离心管)最好用新的，并且用报纸包好，121'C高压灭菌，灭菌40 min，或连续两次121'C高压灭菌，每次灭菌20 min，然后用烘箱烘千。
3、 所有溶液配制好后，加DEPC水使DEPC uJ浓度为0.1%, 37℃过夜，1211C高压灭菌40 min.(其中Tris因为不能用DEPC处理，所以Tris用DEPC处理的水溶液灭菌后配制。)
试验步骤：
【根据文献(Shujun Chang, 1993) CTAB法，稍作改进。】
1、 将4mL提取液加入到lOmL离心管c卜650C水域加热。
2、 用液氮冷却研钵，在研钵中加入少量的抗氧化剂PVP，取1g低温冷冻的银杏叶片，迅速置于研钵中，不时加入液氮以防止研磨过程中叶片融化，充分研磨后，立即加入到预热好的提取缓冲液中，用手摇功混匀。
3、 65℃，水域1 min后冷却至室温。
4、 加入等体积(4mL)的氯仿:异戊X17 (2=L: 1)，混匀，10000rpm, 40C，离心10 min。
5、 小心吸取上清液，加入等体积(4mL)的仿:异戊醇(24: 1),混匀，10000rpm, 40C,离心10 min。
6、 吸取上清液，加1/4体积的IOMLiCL,混合，4℃沉淀过夜，然后10000rpm离心20 min。
7、 用枪吸干，用500u L SSTE溶解沉淀，转到1.5m L离心管.加等体积氯仿:异戊醇混匀，10000rpm, 40C，离心10 min。
8、 离心吸取取上清液，加两倍体积的无水乙醉，-70℃沉淀至少30 min，或一200C下沉淀2 h。
9、 12000rpm, 40C,离心20 min，去上请用70%的乙醇洗两次，吹干沉淀。
10、 用40 u LDEPC处理的水溶解沉淀，得到RNA样品。
11、 除用于电泳和紫外检测外，其余RNA-70℃冰箱保存备用。
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