1 范围
本章规定了测定HIV病毒载量常用方法的实验室条件、方法、结果判定以及应用,适用于血浆中HIV病毒载量的测定。
2 规范性引用文件
Guidelines for the Use of Antiretroviral HIV-Infected Adults and Adolescents MMWR Recommendations and Reports April 24, 1998/47(RR-5); 42-82.
Chiron® Product insert (Quantiplex® HIV-RNA), L6170 rev 5.0, June 1994 Roche AMPLICOR HIV MONITOR™ TEST Procedure Manual.
Fractions of HIV-1 Seropositive Persons by Two Nucleic Acid Amplification Assays, AIDS. Research and Human Retrovirus 1993; (9):259-265.
http://www.niaid.nih.gov/daids/vir_manual/full_vir_manual.pdf
3 实验室条件
3.1 实验室功能分区
3.1.1 实验室原则上应分为4个独立工作区
试剂准备区、样品处理区、扩增区和扩增产物分析区，并设在不同房间。前两区为扩增前区，后两区为扩增后区。各区的功能是：
3.1.1.1 试剂准备区：扩增试剂的配制、分装和保存。
3.1.1.2 样品处理区：样品登记、分装；核酸提取、保存和加样。
3.1.1.3 扩增区：核酸扩增。
3.1.1.4 扩增产物分析区：扩增产物的测定、结果分析、登记及报告。
3.1.2 扩增前区与扩增后区应严格分开，须使用不同的房间，两区之间最好有一定的间隔。
3.1.3 使用商品化试剂盒可在样品处理区进行少量试剂配制。
3.1.4 在满足下列操作和清洁处理要求的前提下样品处理区和试剂准备区可设在同一房间内：
3.1.4.1 在生物安全柜内操作。
3.1.4.2 每个实验人员、实验组分别使用各自的试剂及耗材。
3.1.4.3 盛放污染材料的器皿密封并一次性使用。
3.1.4.4 用有效的方法对操作区域和共享器具在实验前后进行清洁及消毒。推荐的程序是：
（1）实验前将次氯酸钠溶液或70%乙醇涂布于操作台或器具表面，两分钟后用纸巾擦除。
（2）移入盛放污染材料的器皿、所需的试剂、耗材和样品，进行试验。
（3）一个实验区域在同一时间段只进行一种实验。
（4）实验结束后，移出个人专用材料至个人专用区域保管；封好污染材料盛放器皿并移至污物袋；移出共享器具至专门区域保管；将次氯酸钠溶液或70%乙醇涂布于操作台或器具表面，两分钟后用纸巾擦除；打开紫外灯照射至少15min。
3.1.5 各区域的仪器、设备、器具、工作服和试剂应为该区专用，不得交叉使用。
3.2 人员
进行HIV核酸检测的人员须具有艾滋病实验室的上岗资格，并接受过省级以上艾滋病实验室安全及实验操作技术培训。
3.3 设施和设备
3.3.1 根据检测项目配备相应的设施和设备。
3.3.2 各区域的设施和设备应为区域性专用，开展特定试验时应根据要求在相应区域放置专用设备。以下是各区域应配备的设备：
3.3.2.1 试剂准备区：冰箱、洁净工作台、离心机、加样器、振荡器、废弃物容器。
3.3.2.2 样品处理区：冰箱、生物安全柜、离心机、加样器、振荡器、恒温水浴、上下水设备、废弃物容器。
3.3.2.3 扩增区：核酸扩增设备、冰箱、离心机、加样器、废弃物容器。
3.3.2.4 扩增产物分析区：冰箱、离心机、加样器、
电泳仪、振荡器、恒温水浴、上下水设备、废弃物容器、核酸污染物处理设备等。
3.3.2.5 配备-80℃冰箱。
3.3.3 各区域应备有工作人员专用的工作服或一次性工作服、帽子和鞋套，必要时配备防护眼镜和/或口罩。
4 方法和试剂
4.1 方法
常用的HIV
RNA定量测定方法有逆转录
PCR试验（RT-
PCR）、核酸序列扩增试验（NASBA）、分支
DNA杂交试验（b
DNA）。不同病毒载量检测方法的比较见表2（John G. Bartlett M.D.and Joel E.Gallant M.D., Medical Management of HIV Infection 2004 Edition p1-5）。
4.2 试剂
HIV
RNA定量检测包括b
DNA、RT-
PCR、NASBA试剂。
5 实验室管理
HIV核酸检测实验室应制定严格的管理制度，工作人员必须充分了解各项规定并严格遵照执行。
5.1 生物安全
必须符合艾滋病实验室的通用生物安全要求。
5.2 严格执行分区制度
5.2.1 按照要求严格进行实验室分区。
5.2.2 各区域只用于特定的操作，不得从事其它工作。
5.3 仪器和材料的专用制度
仪器、设备、材料、设施均应按工作区域进行标识，不得交叉混用。
5.4 单向流向制度
5.4.1 实验材料,包括：样品及其扩增产物、实验器材（容器、板架、个人护具）、试剂、记录纸、笔、清洁材料等,只能从扩增前区流向扩增后区，即从试剂准备区→样品处理区→扩增区→扩增产物分析区，不得逆向流动。
5.4.2 实验室的气流也应从扩增前区流向扩增后区，不得逆向流动。
5.4.3 尽量减少人员由扩增后区返回扩增前区的频度。
5.5 废弃物处理制度
5.5.1 所有废弃物应按照HIV污染物品处理。
5.5.2 由专人按特定程序和方法进行清洁和消毒。
5.6 质量控制和评价
5.6.1 制订质量保证计划，包括内部质量控制和参加室间质量评价的程序。
5.6.2 建立内部质量控制制度，每次需加入不同浓度的标准对照。
5.6.3 定期接受室间质量评价。
6 HIV核酸定量检测的意义
6.1 辅助诊断
在一般情况下，HIV抗体检测足以对HIV感染与否做出正确诊断，但在特殊情况下，单纯抗体检测不足以完成明确的判定，如出现某些非典型的抗体反应形式，特别是不确定反应时，
RNA的测定可提供非常有用的证据。虽然单纯使用
RNA测定不能完全确定感染与否，但当
RNA测定出现较高拷贝数的阳性结果时（>3，000c/ml），感染发生的可能性非常大。
需要指出的是，每一种
RNA定量系统都有其最低检测限，即可以测出的最低拷贝数，通常在50~100c/ml以上，
RNA定量检测时未测出不等于样品中不含有病毒
RNA。另外，许多AIDS病人/HIV感染者在接受抗病毒治疗后其病毒载量可降至非常低的水平，还有少数HIV感染者在感染后长期处于病毒水平非常低的状态，进行
RNA测定时往往测不出来。因此，使用此指标应综合其它检测数据和样品背景情况进行综合判断。
6.2 早期诊断
在HIV感染的窗口期无法使用抗体检测进行诊断。而在感染早期，在抗原峰出现前后通常出现一个病毒载量的高峰，此高峰通常高于发病时的血浆病毒水平，并且有证据表明这个时期的病毒具有很高的感染能力。这个高峰在免疫系统产生反应后，尤其是在细胞免疫出现后开始下降。因此早期病毒
RNA测定具有特殊的意义。该方法也可用于HIV感染孕妇所生婴儿的早期辅助诊断。
目前国际上正在尝试使用这种检测对采供血样品进行多个样品混合后的
RNA检测以减少窗口期危险（降低“残余危险度”）。
6.3 病程监控
根据HIV感染发生后病毒载量具有一定的变化规律，并且这种变化与疾病的进程有着密切的相关性。因此定期进行病毒载量的检测有助于确定疾病发展的阶段，以确定相应的治疗方案。
通常在HIV感染后无症状期内发生的感染或其它临床症状很难与AIDS发病时的症状区别，为确定一个刚发生的症状是否与HIV的感染有关，医生往往需要观察病人的实验室指标，病毒载量就是一个非常重要的指标。
6.4 指导治疗方案及疗效判定
临床实践证明，并非在任何情况下HIV感染者都应该进行抗病毒治疗。这不单是经济上的原因，更重要的是由于抗病毒药物的副作用和疗效原因。通常在病毒载量达到一定水平后（如>35，000~50，000c/ml）抗病毒治疗才具有良好的效果。
在进行治疗后，通过病毒水平的检测才能确定治疗是否有效，通常在治疗前后病毒水平降低0.5 log以上才被认为临床有效。
6.5 预测疾病进程
HIV感染后疾病进程与病毒载量的关系十分密切，观察HIV感染者病毒
RNA水平可大致预测其发病的可能。病毒载量与6年发病率的关系为：<500c/ml时5.4%;501~3，000c/ml时16.6%;3，001~10，000c/ml时31.7%;10，001~30，000c/ml时55.2%;>30，000c/ml时则为80%。
当HIV感染者CD4 T细胞计数＜200/μl时，病毒载量与3~6个月发展至AIDS的危险为：＜10，000c/ml为4.9%;10，000~29，999c/ml为12.7%;30，000~99，990c/ml为17.7%;＞100，000c/ml为22.4%。在CD4 细胞数相同的情况下，年纪大的比年轻患者发展至AIDS的危险更大（AIDS 2004；18：51-58.）。
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