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RNA 抽提中自备有机溶液的配制及保存问题 (ZHUAN )

点击： 作者：51protocol收集 来源： 时间： 2007-08-17 　本站论坛

假定你抽提 RNA 时使用到的有机试剂 - 氯仿、异丙醇、无水乙醇 - 都是国产的 (这是完全可以使用的)。我的问题是：你采取了什么措施来降低或者杜绝 RNase 的污染？具体地：

你是如何选择、预处理、使用和保存氯仿和异丙醇？
你是如何配制和保存 75% 乙醇？

坦率地讲，因为有机试剂的问题导致抽提失败，我真没有听到；或许有的问题是由有机试剂导致，但使用人也多是不会怀疑到这一点的。恐怖分子的行为倒是听到过：对氯仿、75% 乙醇进行高压灭菌处理。令我无言的是，这样的恐怖行为既没有导致恐怖的后果，也没有影响实验的成功。

不过我还是想提供一些建议。我关注的是质量控制，而不是单单是简单或者方便。

RNA 抽提中涉及的有机试剂，包括苯酚、氯仿、异丙醇、乙醇。苯酚多为商品化的东西了，选择和保存都不应该有什么问题；只强调一点：尽管 Tris 饱和的苯酚也可以用于 RNA 的抽提，但使用水饱和苯酚会更好一些，因为 RNA 在 pH 7 以上的溶液中，发生降解的机率大大提高。下面是关于氯仿、异丙醇、乙醇的有关建议。

选择
国内大的化学试剂公司生产或者监制的分析纯级别试剂就完全可以满足要求。

预处理
不需要进行任何的预处理。绝对不可以高温高压灭菌：这不是该不该的问题，而是能与不能的问题。这三个试剂的沸点都低于 100C，高温高压可能导致危险。

75% 乙醇的配制
一份无菌无酶的水与 3 份 (体积)无水乙醇混匀即成。不要使用量筒等过渡容器，使用天平来秤量：水的比重为 1，无水乙醇的比重按 0.785 计算。是先将无水乙醇倒出部分后再加入水，还是往装水的瓶子中加入无水乙醇，没有什么区别。事实上，70% - 80% 的乙醇都具有较好的洗涤能力，同时也不会导致片段比较大的核酸的丢失，所以，配制时就不要为了准确而左勾右兑的。关于现用现配，从质量控制角度看，不是一个好的办法；这也是你永远发现不了75% 可能会有问题的基础。75% 乙醇也不可以高温高压灭菌，原因同无水乙醇。

保存
首先，要使用新的试剂；试剂架上别人使用过并写有标记的，一定要找当事人确定，以防已被用于其它用途而标记未改。其次，分成相对小一点的包装 (50ml – 100ml)；500ml 的瓶子取液是非常不方便的，移液器的杆子往往都进入了瓶口里，非常容易造成污染。第三，塑料瓶子密闭性好，装醇类试剂是非常好的选择；但氯仿绝对不要使用塑料瓶子。第四，盖紧瓶盖，作好标记，再在瓶子上盖上一个透明塑料袋防尘。第五，保存于室温。
将有机试剂保存于冰箱的人不在少数，但这么做却是令人奇怪的。首先，任何挥发性的东西都不保存在冰箱 (除非万不得已，如 DEPC)，这应该成为一个良好的习惯。其次，与外面相比，冰箱除了灰尘少一点外，什么都会比外面多的。第三，在室温打开低温的瓶子，将导致空气大量进入瓶子，增加了污染的风险。

使用
非常幸运的是，有机试剂对菌污染和酶污染似乎有我们想象不到的抑制和灭活作用，所以，使用这些试剂没有特殊的要求，按正常抽提 RNA 的要求就完全可以了。吸取有机试剂时，最好使用比要吸取的体积大的移液器，因为有机试剂有越吸越多的现象，试剂容易接触到移液器的杆头 – 污染不说，氯仿会腐蚀杆头的。75% 乙醇使用一次性的吸管移取，一次可以吸数 ml，既快又方便。如果舍不得丢弃，用完后放入塑料自封袋中保存，是非常安全的。

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