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热门关键字：　细胞培养　 pcr 　琼脂糖凝胶电泳　质粒DNA的提取　凝胶加样缓冲液　 PCR inventor

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差异基因表达研究方法介绍

点击： 作者：佚名 来源：网络 时间： 2008-09-09 　本站论坛

差异基因表达的研究受到了广泛的关注，常用的技术有DD-PCR；GENE-FISHING；GENE CHIP等。简单介绍如下：

DDRT—PCR技术即mRNA差异显示聚合酶链式反应技术，此技术是以PCR技术和聚丙烯凝胶电泳技术为基础，结合银染或放射性自显影等显色技术，能快速有效地鉴定并克隆两个或多个平行材料之间的差异表达基因。DDRT—PCR技术的基本过程如下：
①提取两组平行材料中的总RNA或mRNA；
②在逆转录酶作用下，以Oligo dT12MN为锚定引物将mRNA反转录成cDNA；
③ 以cDNA为模板利用10一mer随机引物和锚定引物进行PCR扩增；
④ 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离PCR扩增产物，结合银染等显色方法获得平行材料间的差异cDNA片段，回收并再扩增差异片段；
⑤Northern blotting检测差异cDNA片段是否为阳性片段；
⑥克隆cDNA片段并测序；
⑦ 根据测序结果筛选cDNA文库或使用RACE技术获得cDNA片段侧翼序列，进而获得其全长cDNA基因。

GeneFishing技术用来检测不同样品间的表达差异。该技术着眼于解决目前用来检测基因表达差异的方法所面临的问题，如芯片技术和差异显示技术。该技术的实验包括以下三个步骤，反转录PCR (RT) 和两步法PCR (GeneFishing PCR)。
第一步: 用dT-ACP1引物合成cDNAs的第一链。dT-ACP1引物的3′端与mRNA的多聚A互补。这样第一链cDNA包含了dT-ACP1引物 5%26acute;端的通用序列。
第二步: 把第一步得到的第一链cDNA稀释后和随机ACP及dT-ACP2一起加到PCR管。随机ACP引物的3′端序列能有效的结合到第一链cDNA的某一部位。在第一步PCR时，通过控制条件只能使随机ACP的3′端特异的结合到第一链cDNA的特定位置，而阻止dT-ACP2的3′端退火结合到第一链cDNA。通过第一步PCR合成第二链cDNA，其3′端包含了dT-ACP1通用序列的互补序列，而其5′端包含了随机ACP的通用序列。第三步: 来自第二步的PCR管的混合物在更严格条件下进行第二步PCR，这时使dT-ACP2和随机ACP能各自退火结合到第二步得到双链cDNA的3′ 端和5′端。既然第二链cDNA的3′端序列与随机ACP引物的通用序列互补，而其5′端与dT-ACP2的通用序列互补，这样保证了只扩增目标产物。该技术特点如下
(1) 无假阳性。GeneFishing技术鉴别的差异表达基因均可通过Northern Blot分析或RT-PCR证实！现有的DEG检测方法，例如生物芯片和差异显示技术的主要瓶颈就是假阳性的存在。无假阳性可以使研究者能快速辨别可信的差异表达基因。
(2) 无需PAGE（聚丙烯酰胺凝胶），琼脂凝胶法即足够。退火控制引物(ACP)极大地提高了PCR扩增的特异度和灵敏度，从而产生特异PCR产物。而且，GeneFishing 技术只需要少量的起始物质。PCR产物可以在标准的溴化乙啶染色的琼脂凝胶中被检测，因而省去了使用PAGE（聚丙烯酰胺凝胶）的繁琐处理步骤。使用GeneFishing 技术在琼脂凝胶中产生的条带具有足够浓度，可以被Northern Blot方法检测。
(3) 无需昂贵的检测方法。放射性/荧光检测方法由于其成本和危险性而不能广泛应用。昂贵的检测方法是现今差别表达基因检测的另一缺点。因此，可以使用标准溴化乙啶染色的琼脂凝胶来进行检测是GeneFishing 技术的一个主要优势。
(4) 重复性保证。GeneFishing技术的所需反应试剂均由试剂盒提供。这样防止了由于使用旧的，不匹配的试剂而带来的变化，确保了可靠的重复性。
(5) 无需特殊技术。GeneFishing 技术是一种以PCR技术为基础的创新方法，简单易用。
(6) 快速经济。GeneFishing技术使得研究者可以在５小时内确认有效的差异表达基因，不必因为假阳性而浪费时间。相比之下，所有其他DEG筛选方法都需要大量的后续工作和时间来鉴别有效的差异表达基因。
(7) 大范围的PCR产物。每一个GeneFishing PCR反应产生从150bp至2kb长度范围的PCR产物，这不仅提高了鉴别差异表达基因的机会，还为预测基因功能提供了更多的有效序列信息。

基因芯片技术的原理类似我们日常所说的计算机芯片，只是在固体基质上的不是集成着各种半导体管，而是成千上万的基因探针，待分析的样品通过和芯片中已知序列的DNA片段碱基互补杂交，经过计算机的分析，从而确定待测核酸序列和性质，表现出基因表达量和一些序列本身的特性。该技术主要包括四个环节：芯片微列阵制备，样品制备，生物分子反应和信号的检测分析。目前的制备方法主要是采用表面化学的方法或是组合化学的方法来处理固相基质，如玻璃片或硅片。在固体材料中刻出微滤栅、微通道，并加上微泵、微阀来控制流体。然后将探针以预先设计的顺序固定在固体基质上。微列阵制备技术主要有两种基本方法：原位合成法和点样法。

以上三项技术比较如下：

发现新基因

假阳性

PCR产物长度

检测方法

重复性

GeneFishing

能

没有

达到2kb

琼脂糖凝胶

高

Gene Chip

否

高

N/A

荧光

低

DD-PCR

否

高

100-500bp

荧光或放射

低

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