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热门关键字：　细胞培养　 pcr 　琼脂糖凝胶电泳　质粒DNA的提取　凝胶加样缓冲液　 PCR inventor

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原位PCR介绍

点击： 作者： 来源： 时间： 2007-10-27 　本站论坛

问题分析：
做原位PCR时组织处理有何要求？
参考见解：处理后的标本，既要保持组织，细胞的形态结构，并增加细胞膜通透性，又要充分暴露拟扩增的目的DNA或RNA，使引物、探针能有效进入胞浆中发生反应。
原位PCR实验主要的应用范围有哪些？
参考见解：（1）检测外源性基因片段，提高检出率，集中在病毒感染的检查上，如HIV、HPV、HBV、CMV等；（2）观察病原体在体内分布规律（3）内源性基因片段，如人体的单基因病、重组基因、易位的染色体、Ig的mRNA段、癌基因片段等。（4）检测导入基因；（５）遗传病基因检测如β－地中海贫血。
原位PCR实验的大致过程是什么？
参考见解：实验用的标本是新鲜组织、石蜡包埋组织、脱落细胞、血细胞等。其基本方法为多聚甲醛固定组织或细胞，蛋白酶消化处理组织；在组织细胞片上滴加PCR反应液进行扩增，覆盖并加液体石蜡后，在原位PCR仪上进行PCR循环扩增，PCR扩增结束后用标记的探针进行原位杂交，最后显微镜观察结果。
做原位PCR实验玻片怎么处理？
参考见解：清洁液清洗→自来水冲，烘干→强酸24h→自来水，蒸馏水洗，烘干95％乙醇数小时→烘干，高压消毒。再用多聚赖氨酸APES(3-氨丙基三乙氧硅烷)包被。
固定液的选择标准是什么？
参考见解：保持组织结构，最大限度地保持细胞内DNA或RNA水平，使引物和探针更易于进入细胞内，在规定的时间内进行反应。
原位PCR实验所采用的组织固定液和固定时间有哪些？
参考见解：

固定剂

固定时间

细胞

组织

甲醇／丙酮(1:2)

4min

20min

甲醇／丙酮(1:1)

4min

20min

4％多聚甲醛

30min

60min

2％戊二醛

30min

60min

10％中性福尔马林

overnight

PCR和原位PCR在概念上有什么区别？
参考见解：PCR是提取细胞或组织中的DNA进行基因扩增反应，而原位PCR是保持细胞或组织的完整性，使PCR反应体系渗透到组织和细胞中，在细胞的靶DNA所在的位置上进行基因扩增，不但可以检测到靶DNA，而且还可以了解靶DNA存在于何种细胞中，更有利于探讨靶DNA与细胞之间的关系。
PCR所采用的反应体系能否应用于原位PCR，各反应成分有什么异同？
参考见解：PCR与原位PCR所采用的反应体系中都包括Taq聚合酶缓冲液、Mg2＋、K＋、4×dNTP、一对特异性引物和Taq聚合酶。但是由于组织细胞间质会吸附Mg2＋，所以原位PCR中采用的Mg2＋浓度要比PCR的要高，采用4.5-5.5mM可以保证有足够的Mg2＋进行反应。另外由于原位PCR中的基因扩增过程中，各反应成分须经过渗透到靶DNA处才能进行扩增，所以建议将反应循环数增加到35 个。
做原位PCR需要什么特殊设备？
参考见解：原位PCR反应是在载玻片的平面上进行，保持水平可以使反应各组分均匀地分布在组织切片上，所以须在原位PCR仪上进行，该仪器不但可以使载玻片保持水平，而且还可以给载玻片进行均匀地加热，保证扩增反应的顺利进行。
用于原位PCR检测的探针有哪些？
参考见解：与原位杂交一样，检测原位PCR结果的探针可以是DNA探针，也可以是寡核苷酸探针，DNA探针的长度在100－200bp为宜，寡核苷酸探针为多个，在20－40bp为宜。
用于原位PCR检测的探针标记物有哪些？
参考见解：常用标记物有地高辛半抗原（digaoxigenin），生物素（biotin），过氧化物酶（HRP），还可以标记一些荧光物质如异硫氰酸荧光素（FITC），花青（cyanine，Cy2，Cy3，Cy5）等。
怎样设定原位PCR对照实验？
参考见解：设立阳性对照，即用已知阳性细胞或组织切片做阳性标志，实验结果应呈阳性，表明实验方法准确可靠。同时要设立阴性对照，即用已知阴性细胞或组织切片作阴性对照，实验结果应呈阴性，表示实验方法无假阳性结果；也可以用实验细胞或组织切片，不加标记的dUTP（直接法），PCR结果显示阴性，或不加引物或不加TaqDNA聚合酶等，结果均应阴性。
原位PCR中直接法和间接法有何异同？
参考见解：直接法：进行原位PCR扩增以前，把同位素或非同位素(常用)标记的核苷(如dig-dUTP及Biotin-dUTP)标记的底物或引物5’末端连接标记物加入PCR反应液中，随着扩增的进行，标记的核苷或引物直接掺入到PCR产物中，然后免疫组化直接进行检测。间接法：先进行细胞内目的DNA基因原位扩增，然后用标记的探针进行核酸分子原位杂交以定位检测扩增的ＤＮＡ的技术，步骤相对较多，需时长，但结果可靠。
获得特异的原位PCR结果需要考虑哪些关键因素？
参考见解：原位PCR技术操作包括了组织学技术、PCR技术、原位杂交技术及免疫组化学技术，因此在复杂的操作过程中，有很多因素影响实验结果。要考虑的一些关键因素有待检组织的有效固定，在PCR前的组织预处理包括酶消化使核酸有效暴露，PCR环节中要设计特异的扩增引物、Mg2＋的浓度、TaqDNA聚合酶用量、反应循环参数。间接法中用原位杂交检测时考虑探针浓度、抗体浓度和显色时间。
原位PCR中的组织预处理和原位杂交是否相同？
参考见解：要获得理想的原位PCR结果，需要将待检组织进行预处理使核酸充分暴露，这和原位杂交组织预处理的原则相同。因此原位杂交中的组织预处理步骤如HCL和蛋白酶处理等同样适用于原位PCR。
PCR相比，原位PCR有什么优势和不足？
参考见解：PCR虽然能扩增包括福尔马林固定、石蜡包埋组织的各种标本的DNA，但扩增的DNA或RNA产物不能在组织细胞中定位，因而不能直接与特定的组织细胞特征相联系，这是该技术一个局限性。原位杂交虽具有良好的定位能力，但由于其敏感性问题，尤其是在石蜡切片中，尚不能检测出低含量的DNA或RNA序列。而原位PCR可使扩增的特定DNA段在分离细胞和组织切片中定位，从而弥补了PCR和原位杂交的不足。
在组织芯片上和在传统的病理切片上进行原位PCR有什么异同？
参考见解：两者实验所需试剂没有差别，但由于组织芯片的高通量特点，比起传统的病理切片来说，所加的试剂量要远远低于病理切片，劳动强度也大大降低。

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