| 原位PCR介绍 | | 点击： 作者： 来源： 时间： 2007-10-27 本站论坛 |
|  | 原位PCR技术自上世纪90年代初建立至今，科学家就一直对原位PCR的技术和应用进行研究，目前该项技术已日臻完善。原位PCR既能分辨带有靶序列的细胞又能标出靶序列在细胞内的位置，在分子和细胞水平上研究疾病的发病机理、临床过程以及病理的转归，其特异性和敏感性均高于一般PCR技术。在病毒学、病理学和肿瘤已经成功展示了许多令人瞩目的成就，具有重要的实用价值。但是，任何事物都具有两面性，原位PCR作为一项发展中的新技术，还存在一些问题，在方法上还有待于进一步改进和完善。
试验原理：
原位PCR(In Situ PCR,IS-PCR)是一种把原位杂交的细胞定位技术与PCR的高灵敏度相结合的技术，即通过PCR技术以DNA为起始物，对靶序列在染色体上或组织细胞内进行原位扩增，使其拷贝数增加，然后通过原位杂交方法检测，从而对靶核酸进行定性定量定位分析。随着PCR技术的发展，出现了以mRNA为起始物，通过反转录合成靶序列的cDNA，然后以cDNA为模板进行PCR扩增，以检测细胞内mRNA靶序列的原位反转录PCR。原位PCR的大致流程主要包括：(1)染色体、细胞及组织切片样品的制备。此阶段中固定很重要，因为并非所有的固定剂都有利于PCR及原位PCR 反应。(2)PCR前处理，包括石蜡切片、去石蜡、染色体变性和细胞穿透，此步既可有利于PCR反应试剂到达靶目标，又可防止扩增后产物漏出，蛋白酶和胰酶是常用的消化膜试剂，不同材料处理的时间和所用酶的浓度有所不同。(3)PCR扩增，一般采用热启动PCR，病毒RNA的扩增需用逆转录PCR。(4)原位杂交及检测。原位PCR按检测方法不同分为：直接原位PCR；间接原位PCR；原位反转录PCR；原位再生式序列复制反应。
主要试验步骤：
对DNA靶序列的PCR扩增主要由高温变性(94℃×1min)、低温退火(55℃ ×3min)、适温延伸(72℃×2min)三步组成一轮的热循环重复而成。理论上每次循环PCR产物以2n指数递增，经20～25次循环后，PCR产物的积累可达到最大值，可使靶序列扩增106～7倍。但在实际操作中，每步反应率不可能是100%，因此一般循环次数设定为25～30次。过多的循环次数(>30次)之后酶的催化反应趋于饱和，就会出现“平台效应”。
1、 载玻片用DEPC水洗1min使蛋白酶失活，再用无水乙醇洗1min，室温干燥。此简单步骤即可去除/灭活蛋白酶，不需加热灭活。
2、 取2张切片分别加入：1?l 10×缓冲液(此液由35?l 3mol/L NaAc， 1mol/L MgCl2和60?l DEPC水配制而成)，1?l无RNA酶的DNA酶，8?lDEPC水。
3、 用一个灭菌的聚丙烯塑料封条盖住溶液以防止干燥，将载玻片置于一个37℃的湿容器内。
4、 过夜消化，除去封条，用DEPC水洗1min，再用无水乙醇洗，室温干燥。
5、 取一张经DNA酶消化的切片，加入下列溶液：2?l MgCl2(25mmol/L贮存)， 1?l RT缓冲液，1?l dATP、dCTP、dTTP(每种以10mmol/L贮存)，1.5?l DEPC水，0.5?l 3′端引物(20?mol/L贮存)，0.5?l RNA酶抑制剂，0.5?l反转录酶。这些试剂在RT-PCR试剂盒中均有。
6、 为了防止干燥，用一小滴指甲油固定住封条，将载玻片放入PCR仪的加热铝板上，盖灭菌矿物油，42℃反应30min。
7、 除去封条，用二甲苯洗5min除去指甲油，再用无水乙醇洗5min，室温干燥。
8、 每一张载玻片加2.5?l PCR缓冲液，4.5?l MgCl2(25mmol/L贮存)，4.0?l dNTP(每种核苷酸终浓度200?mol/L)，1.0?l 2% BSA，0.4?l地高辛标记的dUTP(1mmol/L贮存液), 1.0?l引物1(20?mol/L), 1.0?l引物2(20?mol/L), 11?l水, 0.5U Taq DNA聚合酶。
9、 加入上述25?l溶液到载玻片上，盖上封条，用指甲油固定。
10、 PCR仪加热至80℃，加入预热的矿物油，终止程序，升温至94℃，运行PCR程序： 94℃ 1min、55℃ 3min、72℃ 2min25个循环。
11、 去除封条和矿物油，用二甲苯洗5min，乙醇5min，室温干燥。
原位PCR的分类：
直接原位PCR：
直接法原位PCR是使扩增产物直接携带标记分子，在原位PCR反应体系中使用标记的三磷酸核苷酸或引物。地高辛-11-dUTP，生物素(荧光素-dUTP)和放射性同位素(3H-CTP)是最常用的三种标记物。当标记物进行PCR扩增时，标记分子就掺入到扩增产物中，可用放射自显影技术、免疫组织化学技术或亲和组织化学等技术检测扩增产物。直接法原位PCR的优点是快速、简便，曾一度被认为可完全代替间接法，但现已证明其结果的特异性不够。即使使用了严格对照的固定、蛋白酶消化和热启动程序，也容易出现许多较强的假阳性信号，严重干扰特异性信号的检测，尤其是在组织切片上进行原位PCR，其扩增效率较低。
间接原位PCR：
间接法原位PCR是目前应用最广泛的靶核酸序列原位扩增技术。Haase等于1990年首次报道原位PCR时，用的就是间接法。他们用经固定的细胞悬液做PCR扩增，然后将细胞离心沉淀在玻片上，再对扩增产物进行原位检测。间接法原位PCR的反应体系与常规PCR相同，所用的引物和三磷酸核苷酸都不带任何标记物。当PCR原位扩增结束后，再用原位杂交技术检测特异性扩增产物。由此可见，间接法原位PCR与原位杂交技术结合，故亦称为PCR原位杂交(PCR in situ hybridization,简称PISH)。
与直接法原位PCR相比，间接法虽然复杂些，多了原位杂交检测步骤，但它 扩增效率较高，更重要的是特异性比直接法强。理论上说，在靶标记上，介于两引物间的区域的探针的特异性是最完美的，而原位杂交所用的探针符合这一标准，可特异性地检出扩增产物中的靶序列。这样，即使扩增产物中有非靶序列成分，它们也不会呈现阳性反应，因而提高了原位PCR的特异性。原位杂交的方法很多，原则上都可用于结合PCR技术。但还是以非同位素标记物，如地高辛、生物素标记的寡核苷酸探针原位杂交较为常用。
原位反转录PCR：
原位反转录PCR(in situ reverse transciption PCR,简称In Situ RT-PCR)是结合反转录反应和PCR扩增检测细胞内低拷贝mRNA的方法。全过程分两步进行。第一步以mRNA为模板，在逆转录酶的催化下合成cDNA。第二步则以cDNA为模板，用PCR对靶序列进行扩增。与液相反转录PCR不同的是，原位反转录PCR反应过程在固定的组织细胞标本上进行。进行原位反转录PCR的标本先要用DNA酶处理，以破坏组织细胞中的DNA。这样可保证PCR扩增的模板是从mRNA反转录合成的cDNA，而不是细胞中原有的DNA。处理时可将150～300?l不含RNA酶的DNA酶滴加在标本上，再剪一块比标本略大的蜡膜轻轻地覆盖在液滴上。注意将蜡膜的清洁面向着标本。然后切片置于湿盒内，室温下孵育过夜。处理结束后，标本用PBS洗涤5min。如果PCR扩增的引物与细胞本身的基因DNA相距甚远，残留在细胞中DNA就不会被扩增。在这种情况下，标本则可不必用DNA酶处理。第一步反转录反应一般在42℃下进行30～60min。此时，在有逆转录酶、随机六聚物(random hexamer )和游离核苷酸存在的条件下，以mRNA为模板合成cDNA。反转录反应结束后，可将标本加热至90℃以上，以灭活逆转录酶，或用PBS洗涤5min，将逆转录酶洗去，接着以cDNA为模板进行第二步PCR扩增。
例：直接原位单拷贝PCR
DISC-PCR不需要手边有克隆的基因，只要有合成PCR引物足够的序列资料即可用于定位哺乳动物染色体上100－300bp的短序列，它特别适合于序列界标(STS)的物理定位，也可以用于绘制表达序列标记(ESTs)。目前其最大的不便是完成程序之后分带比较困难，而且必须分析数目庞大的中期分离染色体。
试验试剂：
1． 淋巴细胞的培养和中期染色体的制备部分
PBS KCM培养液：20mmol/L NaCl，120mmol/L KCL，0.1%TritonX-100，10mmol/L Tris-HCl pH8.0
RPMA-1640??培养液
乙酰甲基秋水仙碱储存液：10μg/ml水溶液，滤过消毒。
0.3%谷氨酰胺储存液
胎牛血清(FCS)
Lymphopaque
脂多糖
2． 直接原位单拷贝PCR(DISC-PCR)部分
10mmol/L dATP、dCTP、dGTP、dTTP
5mmol/L生物素-16-dUTP
寡核苷酸引物可在ABI DNA合成器上合成。除了常规乙醇沉淀和洗涤，不需要进一步纯化即可直接使用，浓度为20μmol/L
Taq DNA 聚合酶
10×Taq 聚合酶缓冲液 100mmol/L Tris-HCl pH8.3，500mmol/L KCl, 15mmol/L MgCl2，0.1%BSA
3． 信号检测部分
20×SSC
PBS缓冲液调pH值到7.4
工作缓冲液 100mmol/L Tris-HCl pH7.5，150mmol/L NaCl，0.2% Tween，0.3% Triton
阻断缓冲液 100mmol/L Tris-HCl pH7.5，150mmol/L NaCl，0.5%阻断剂(BMB Genius Kit)，配制时，先配Tris - NaCl液，后加阻断剂搅拌到至溶解，约需1h。
链霉素抗生物素辣根过氧化物酶，1mg/ml。
四甲基联苯胺
试验步骤：
1. 从小鼠脾细胞中培养淋巴细胞
1、 处死小鼠，取出脾脏。
2、 将脾脏放入培养皿中，用25号针吸5ml RPMI培养液，加压冲洗脾细胞2次，135g 离心洗出液10min, 收集沉淀，重悬于2ml RPMI-1640 培养液中。
3、 加3ml PBS到细胞悬液中，在微离心管内加3ml Lymphopaque,然后将细胞悬液加在Lymphopaque 上，911g 室温下离心20min,可见一清晰条带。
4、 用细移液管取出淋巴细胞，用含15%FCS和0.03%谷氨酰胺的RPMI-1640培养液洗细胞。
5、 低转速沉淀细胞[同第3步]，重悬于10ml RPMI-1640 培养液中，计数细胞。
6、 以106/ml的密度，用含有0.03%谷氨酰胺和15%FCS的RPMI-1640培养液培育10ml细胞，在37℃下培养72h, 然后以0.25mg/ml浓度加入脂多糖，刺激细胞生长。(在培养皿表面分开的淋巴细胞生长为细胞柱，这些细胞柱的数目是衡量培养好坏的指征)。
2. 人血淋巴细胞的培养
1、 用消毒玻璃棒去掉血中纤维蛋白。
2、 用5－10ml PBS稀释10~20ml 去纤维蛋白血液，然后加3.5ml在Lymphopaque上，911g室温下离心20min,可见一清晰条带。吸取淋巴细胞及培养细胞。
3. 用标准技术制备中期染色体
1、 在培养液中加终浓度为0.1μg/ml的乙酰甲基秋水仙碱培养1－2h。
2、 手掌拍打培养瓶侧面使贴壁细胞脱落，135g离心10min收集细胞。真空吸去上清液。
3、 重悬细胞于约10ml低张溶液(如75mmol/L KCl)中，37℃孵育10min或室温2min。
4、 用血细胞计数器检测低张溶液中细胞的浓度，用Ames Cyto-Tek细胞离心机制备中期染色体的最佳细胞浓度是(1~2)×105/ml。用低张KCl稀释校正标本浓度。
5、 将准确体积的标本加样于用乙醇清洗过的玻片上，用2500g离心10min。
6、 在相差显微镜下检查初次展开的细胞的浓度是否需要校正。可以通过调节2－3个浓度参数去获得最佳分离效果。注：如细胞浓度太高细胞散离差，形成稠密堆积；细胞浓度过低引起中期染色体展开或拉长。
7、 用吸水纸吸去细胞边缘多余的液体，在空气中放置2min，然后放入一装有KCM培养液的广口瓶中室温下10min。
4. DISC-PCR
1、 在PBS中洗10min, 在70%、80%、95%、100%乙醇中梯度脱水各5min。
2、 在微离心管中准备如下溶液(每张标本) dATP，dCTP，dGTP各200μmol/L；100μmol/L dTTP；100μmol/L生物素-16-dUTP；1.5μmol/L引物；2.0μl 10×Taq缓冲液；2.5U Tap聚合酶和去离子水20μl。
3、 将以上反应混合液加在有中期染色体的载玻片上，盖上盖玻片。用橡皮粘胶封固盖玻片四周。
4、 室温空气干燥橡皮粘胶，载片边缘涂上一层指甲油。
5、 按以下热循环程序孵育标本 94℃ 3min→退火温度1min→ 72℃ 1min→92℃ 1min , 循环24次(总25次)，最后延长3－5min。
6、 用软纸擦去指甲油，在100%乙醇中提插几次玻片，揭去橡皮粘胶，轻轻的去掉盖玻片(从此步开始应小心不能让标本干，但可用滤纸吸去玻片边缘多余液体)。
7、 立即将标本浸入4×SSC中3min,然后浸入阻断缓冲液中1h。
5. 信号检测
1、 从阻断缓冲液中取出标本，轻轻甩去多余液体，每片加100μl用工作缓冲液按1 ：100稀释的链霉抗生物素辣根过氧化物酶(如果出现背景问题，减少链霉素抗生物素偶联辣根过氧化物酶浓度或(和)增加洗涤时间)。
2、 盖上盖玻片，湿盒中37℃孵育1h。
3、 室温下用工作缓冲液洗10min, 再用0.1mlo/L Tris-HCl pH7.6 洗5min。
4、 加100μl TMB, 盖上盖玻片，室温下1~2min(可呈现蓝色信号)。
5、 用去离子水洗5min。
6、 用快红复染5min, 流水冲洗。
7、 梯度乙醇脱水(40%、70%、80%、95%)各5min。
8、 常规方法封片。
9、 用差相显微镜读片。
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