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多重PCR

点击： 作者： 来源： 时间： 2007-10-27 　本站论坛

退火时间和退火温度：将退火时间从 20 秒改为两分钟并未改变扩增效率，但退火温度却是最重要的参数之一。尽管许多基因能在退火温度为 56 ℃ –60 ℃被特异的扩增，我们的经验表明将退火温度降低 4 ℃ –6 ℃对于在多重 PCR 中扩增出同样的基因是必需的。单独扩增时退火温度为 60 ℃的基因在多重 PCR 中退火温度为 54 ℃时最优。尽管在 54 ℃时可能出现非特异性扩增，但多重反应中并发的其他基因的特异扩增会消除非特异性扩增的影响。相似的，当同时扩增许多特异的基因时，扩增效率高的基因会使扩增效率低的基因的扩增产量降低。这是由于在 PCR 反应中酶和 d NTP 的供应是有限的，所有的产物都是由同样的一组原料生成。
PCR 循环数：引物混合物 Y-3* 被用于扩增两个不同的基因组 DNA 样品，以不同的循环次数做多次实验。其中的一个基因组模板质量更高或 DNA 含量更高。可以看出，当循环数增加时，两组样品的各扩增带的产量都逐渐增加。 PCR 产物量增加最明显是在 25 个循环附近。通常对于一个反应， 28 至 30 个循环足矣，增加至 60 个循环对产物量无明显影响。
多重PCR的应用与评价：
　　多重PCR技术可应用于生物学研究的多个领域，如病原体鉴别、性别筛选、遗传性疾病诊断、法医学研究以及基因缺失、突变和多态性分析等等。多重PCR技术作为一种可靠的检测基因序列的缺失或突变的方法，在假肥大性肌营养不良症(DMD)的诊断中得到应用。半数的DMD病人是由于Dystrophin基因的部分缺失所引起的，根据Dystrophin基因中易于缺失的9个区域的序列，设计合成一系列引物，同一实验中同时扩增这9个区段，电泳分析。正常人多重PCR电泳图谱为9个片段，如果Dystrophin基因中的某一个区段缺失，那么在PCR电泳图谱上就没有相应的条带，据此可以诊断DMD。
　　随着PCR技术的发展，多重PCR技术已经取代了较为烦琐的Southern印迹杂交来检测基因的突变或缺失。应用多重PCR技术，在同一反应管中可以同时检测分析多种目的DNA序列，既节约了实验样本和试剂，而且使操作更加简便，省时省力。
　　与常规的PCR技术相比，多重PCR技术涉及到了多对引物，随着引物对数的增加，也增加了得到错配的扩增产物的机会，因此，需要根据实验的要求、目的以及所设计的引物等等因素，对反应条件进行优化，对多重PCR中的各种影响因素进行组合、调整，以寻找到一个最优的扩增条件，从而可以进行高度特异性的多重PCR，这在对病原微生物的基因检测和临床诊断方面有着十分重要的意义。

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