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◆选用比较多的碱基C。
◆退火温度Tm控制在 68-70C左右。
有用的荧光染料参数
24.Primer设计的基本原则是什么？
答：引物设计的下列原则供您参考。
◆引物长度一般在18-35mer。
◆G-C含量控制在40-60%左右。
◆避免近3’端有酶切位点或发夹结构。
◆如果可能避免在3’端最后5个碱基有2个以上的G或C。
◆如果可能避免在3’端最后1个碱基为A。
◆避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。
◆退火温度Tm控制在 58-60C左右。
◆如果是设计点突变引物，突变点应尽可能在引物的中间。
25.用软件设计的引物为什么不管用？
答：引物是否好用，能否扩增出您需要的引物，与是否用软件设计没有太多的关系。引物设计有一定的指导意见，软件就是根据这些要求设计而成。不要迷信软件给您设计的引物，软件中一些参数您可能不明白，弄错了反而麻烦。其实，PCR扩增的成败最关键的是反应模板的制备和反应条件的控制。软件设计最大的毛病是，有时判断为该基因没有一段区域满足标准引物的要求。有时，我们需要扩增一段基因片段，引物的设计是没有太多的选择的。
26.为什么引物的OD260/OD280小于1.5 ？
答：我们多次接到类似的投诉：引物应该全是DNA,但是OD260/OD280的比值为什么那么低，怎么会有蛋白质污染？遇到这样的投诉有时我们感到很是为难。投诉者有时心情很不好，还不听解释。
撇开其他不谈，引物化学合成，哪里有机会污染到蛋白质？
需要指出的是OD260/OD280的比值不能用来衡量引物的纯度。OD260/OD280的比值过低一般是由于引物中C/T 的含量比较高所致。下表是一个20mer 同聚体引物的OD260/OD280的比值，清楚表明OD260/OD280的比值与引物的碱基组成密切相关。
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