| ［摘要］目的：探讨HBV未分离成功的情况下研究HBV父儿传播途径的可行方法。方法：以巢式PCR检测HBV DNA与序列分析的方法比较父亲与胎儿所携HBV S区nt451～660段，C区nt2022～2321段序列的一致性。结果：父儿间两段序列同源性在98%～100%之间。S区检出491、494、530、546、581位变异致使113、114、126、131、143位氨基酸替代。结论：巢式PCR与序列分析方法是目前病原体未分离成功的情况下研究传播途径的可行方法。
［关键词］乙型肝炎病毒；巢式PCR；序列分析；传播途径
［中图分类号］R512.6＋2 ［文献标识码］A ［文章编号］1003-8507(2000)04-0473-03
IDENTIFICATION OF THE PATHWAY OF TRANSMISSION OF HEPATITIS B VIRUS BY DIRECT DNA SEQUENCE ANALYSIS AND NEST PCR
PENG Gui-fu,WANG Shan-shan,JIANG Pu-lin,et al.
(Institute of Military Medicine,Guangzhou Command PLA,Guangzhou 510507.)
Abstract:Objective:To study the pathway of transmission of HBV from father to fetus under the condition that HBV cant be cultured.Methods:The consistence of S gene nt451～660 nucleotide,C gene nt2022～2321 nucleotide of father and foetus were compared by nest PCR and DNA sequence analysis.Results:The homology of HBV sequence between father and foetus was very high.The mutations of 491、494、530、546、581 nucleotide in the S gene caused substitutions of 113、114、126、131、143 amino acid.Conclusion:The nest PCR and DNA sequence analysis are useful methods in studying the pathway of transmission road when HBV can’t be cultured.
Key words:HBV;Nest PCR;Sequence analysis;Pathway of transmission
乙型肝炎病毒(HBV)的父婴传播已讨论多年［1，2］，由于HBV至今不能分离培养，研究传播仍有一定困难。本研究以巢式多聚酶链反应(PCR)与序列分析的方法研究父儿所携HBV在分子病毒学方面的特点，试图从分子水平证明HBV父儿传播的可能，并探索在病原体未分离成功的情况下研究传播的可行方法。
1 材料与方法
1.1 研究对象 从1995年3月至1996年3月在湖南省某县以HBsAg为指标筛检前来终止妊娠的孕妇及其配偶。选择8名男性HBV携带者与其子宫内受染有胎儿为研究对象。携带者以ELISA检测常规五项HBV血清学标志与PCR检测HBV DNA确定。均无既往肝炎史，谷丙转氨酶正常，无乙肝疫苗注射史，年龄在25～35岁之间。8名配偶以上述方法检测均无HBV感染，年龄在23～33岁之间。夫妇双方血清、白细胞、精液在住院期间收集。取终止妊娠3月以上胎儿。胎儿血在产出当时采取并分离血清保存于－20℃，同时分离白细胞。无菌条件下取肝脏组织。胎儿血清、白细胞、肝脏任何一项HBV DNA阳性者判定为子宫内感染。另外选择5对无HBV标志的夫妇与胎儿为对照。
1.2 检测方法
1.2.1 ELISA检测HBV五项血清学标志：HBsAg、HBeAg、抗-HBs、抗-HBe、抗-HBc。
1.2.2 各种标本的处理及DNA的抽提 抗凝血液标本以白细胞分离液分离白细胞并PBS反复洗涤以除去血液中HBV DNA的影响，恢复体积分小包装低温保存备用；肝脏标本取2g与PBS2ml在无菌研磨器中研磨成匀浆PBS反复洗涤后加PBS2ml后分小包装低温保存备用；精液标本收集后离心将精子与精浆分开，精子以PBS反复洗涤以除去精浆中HBV DNA的影响，以PBS恢复体积分小包装低温保存备用。上述标本末次洗液PCR检测HBV DNA均阴性，各种标本按常规以苯酚、氯仿、异戊醇法提取DNA［3］。
1.2.3 PCR技术检测HBV DNA 引物合成于中科院上海细胞所。S区与C区各设计一对套式PCR引物(表1)。第一轮PCR产物1∶50稀释作为第二轮PCR的模板，每轮PCR均设阳、阴性对照与空白对照。常规PCR方法参考文献［3］。
1.2.4 序列分析 取S区与C区第二轮PCR产物，以醋酸胺与异丙醇纯化用Fmol DNA cycle sequencing system(promega公司)以双脱氧链末端终止法测序［3］。r-32P-ATP购自北京亚辉公司。放射自显影后读片。结果输入计算机用DNASIS软件处理并与发表的序列(genebank)比较。
2 结果
表1 PCR引物序列
引物位置序列
S1R842～8225 TTAGGGTTTAAATGTATACCC3
BS156～76CCTGCTGGTGGCTCCAGTTCC
S3427～448CATCTTCTTGTTGGTTCTTCTG
BS3687～668GGCACTAGTAAACTGAGCCA
C12394～2370GGCGAGGGAGTTCTTCTTCTAGGGG
C31730～1754CTGGGAGGAGTTGGGGGAGGACATT
C21955～1974TTGCCTTCTGACTTCTTTCC
C62348～2330TAACAACAGTAGTTTCCGG
以巢式PCR检测HBV DNA54份标本阳性48份，其中8份父亲血清、2份父亲白细胞、2份胎儿血清、1份胎儿白细胞、1份胎儿肝脏、2份精液为第一轮PCR阳性，其余66.7%(32／48)均是第二轮PCR检测时出现阳性结果。尤其是5份精子标本在第一轮均阴性。共获得7份精液标本2份精子未检出HBV DNA。5例对照胎儿各种标本均无HBV感染标志。
以PCR产物直接测定6对父儿的HBV S基因第451～660位核苷酸。2对父儿的C基因第2022～2321位核苷酸(从HBV的EcoR1酶切位点计算)。6对父儿S区此段序列核苷酸同源性98%～100%。第3、4、5、6例胎儿的此段序列与父亲完全一致，其中第4对父亲血清、精子与胎儿血清HBV基因此段序列完全一致，两个位置均与原型株有差异，第499、508位原型株为C，此对父儿为A、G，此变异未引起表型变化。第1例胎儿个别碱基与父亲不同，491、494、505、544、546、581、586、592位碱基父亲为T、T、C、A、C、A、C、C，胎儿为A、A、T、C、A、T、T、T。第2例胎儿544、546位的变化与第1例相同。第491、494位的变异使胎儿S区第113、114位氨基酸由丝氨酸变为苏氨酸，546位的变异使131位氨基酸由苏氨酸变为天冬酰胺。581位的变异使第143位氨基酸由苏氨酸变为丝氨酸，其它位点均无表型变异。此段序列中父儿共同变异的5个位点即493、499、508、529、530，其中仅第3对父儿在530位由A变G，致使第126位氨基酸由苏氨酸变为丙氨酸，其它均为无表型变异。2例胎儿及父亲的C区2022～2321位核苷酸同源性100%。父儿共同变异的11个位点均为无表型变异，但是对与对之间有差异，第7对父儿2044、2049、2251、2284位为C、C、A、A而第8对父儿为T、A、G、T。
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