| 杨卫华 综述 李 稻 审阅
上海第二医科大学 上海市医学检验重点实验室（上海，200023）
摘要：在众多导致人类疾病的基因有义突变、病原体亚型以及耐药基因的有义突变中，单碱基突变占了相当大的比例，其检测方法的探索一直是基因诊断研究中的重要课题。本文着重介绍了几种近年发展起来的新技术：反向限制性位点突变分析(iRSM)、荧光PCR（SYBR Green I结合熔解曲线分析技术、荧光共振能量转移(FRET)结合探针熔解曲线分析技术）、基因芯片、等位基因特异性扩增技术(ASPCR)。
关键词：聚合酶链式反应 点突变 Tm值 荧光 基因芯片 等位基因
随着人类基因图谱草图的公布和各种病原体基因序列的揭示，这都将极大的促进疾病相关基因的结构和功能研究，特别是基因缺失、错位、突变（有义突变）等与疾病的关系。在众多导致人类疾病的基因有义突变、病原体亚型以及耐药基因的有义突变中，单碱基突变占了相当大的比例[1]，其检测方法的探索一直是基因诊断研究中的重要课题，特别是对已知有义突变的检测，将是临床进行基因诊断的重要手段之一。PCR扩增技术问世以来，建立于扩增基础上的突变检测技术使检测靶DNA（目的DNA）含量和/或突变靶序列比例过低、检测灵敏度不足等难题得以克服，使得分子诊断技术进入了新阶段。在过去十多年中，曾出现了诸如经典的PCR-RFLP、ASO以及OLA、COP、PEX等点突变的检测方法，本文将对近年来发展起来的对已知点突变分析方法进行综述。
⒈ 反向限制性位点突变分析（inverse restriction site mutation , iRSM）
1978年Kan和 Dozy创立的限制性片断长度多态性（restriction fragment length
polymorphism , RFLP)连琐分析技术是最早用于分析已知点突变的方法。其检测特点是：具有较高的特异性，可以确定突变的部位及性质，重复性好。但不足之处是仅适合于多态性的检测：即突变频率大于1%才能被检测到；因此，RFLP分析对于检测突变的早期，尤其是在野生型远多于突变型时其敏感性就显得不足了[2]。
图1.E1→E2突变的检测
为了能够提高RFLP分析技术的敏感性，1999年Jekins等人对其进行了改良，创立了一种名为反向限制性位点突变分析（iRSM）[2]，进行低突变频率等位基因的检测。其方法（如图-1所示）主要用于突变早期的检测，当某一野生型序列发生突变导致原有酶切位点（E1位点）的消失，产生一新的酶切位点（E2位点），称之为E1→E2突变，但突变频率较低常规RFLP无法检测。此时，用一内切酶(E1)对其进行酶切，这样可选择性地移去大部分的野生型序列（>99%）。无酶切位点的部分通过PCR扩增（引物被设计在E2位点的一侧），产物用另一内切酶（E2）进行RFLP分析，根据产物中是否存在E2位点即可判断有无突变发生。
由于该方法在RFLP分析之前用另一种内切酶对靶序列进行消化，减少了野生型序列的含量（一般消化率>99%），因而大大提高了突变序列的检出率。值得注意的是：只要选择适当的限制性酶切位点，此项技术适应于任何基因、突变或生物体。但是，由于聚合酶的关系，可能在PCR扩增后导致iRSM分析出现假阳性。这可以通过使用高保真聚合酶进行修正；同时为了提高检出率，iRSM分析可于其它分析技术联合使用或增加目的基因的含量[2]。
⒉ 荧光PCR检测点突变
自RFLP第一次进行点突变检测以来，此后的20余年中诞生了不下20余种检测法，近年来随着自动化荧光检测技术的建立，其取代凝胶及放射性标记分析产物的趋势已经形成[4]。这就意味着以荧光为标记物的检测技术在不远的将来可能在突变检测中占有重要的一席之地。
2.1 SYBR Green I结合熔解曲线分析点突变
SYBY Green I是一种双链特异性的DNA染料，只与双链DNA结合，并且单个存在时并不发射荧光，只有当多个SYBY Green I嵌入双链时才能被检测到。当此双链通过变性温度时产生的荧光会快速衰减而形成特异的熔解曲线，如果在PCR扩增循环过程中对SYBY Green I发出的荧光进行持续监测，那么利用这一特征可对不同产物的变性进行观测[5]。产物的熔解曲线取决于GC含量、序列长度以及碱基序列。如果扩增产物中存在突变型序列，那么在变性过程中它与野生型序列之间解链温度即Tm就会产生差异。Tm相差2℃以上，就可通过它们各自的熔解曲线将其分离[6]。
这种点突变分析技术的特点是简单、快速、自动化程度较高，易于推广；但是所用的染料SYBY Green I与溴乙啶[7]、YO-PRO-1[8]一样，缺乏序列特异性，因此不可避免的将会降低其敏感性。在扩增过程中产生的非特异性荧光，通常是由引物二聚体和其它污染物的扩增产物引起的，单以荧光很难将其与靶序列发出的荧光相区分。另外扩增产物碱基序列数较大时，单个碱基置换引起的点突变其Tm变化较小，运用SYBR Green I和熔解曲线分析就很难检出[6]。
2．2 荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer , FRET）结合探针熔解曲线分析点突变
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