PCR技术：样品处理与注意事项

　　③配制（DEP）溶液用无水乙醇将DEP作9 1稀释，再用NP-400.5%作1：999稀释（抑制RNase）；

　　④细胞沉淀中加200～400μl此溶液，旋涡混合；

　　⑤13000×g离心10s；

　　⑥上清转移至新管中，37℃保温20min，90℃，10min；

　　⑦离心，上清转移至新管。取5～10μl作反转录；

　　⑧如果反转录失败，可能因DEP残留，可将样品再在90℃加热5min，再做试验；

　　⑨本法也可用于培养细胞。

　　二、注意事项

　　PCR只需几个DNA分子作模板就可大量扩增，应注意防止反应体系被痕量DNA模板污染和交叉污染，这是造成假阳性最大的可能。下例可形象说明污染的严重性。

　　典型的PCR反应可在100μl反应液中扩增10¹²个DNA，此液倾入50nm×25m×2m的游泳池中，充分混合取0.1ml池水,其中含有40个分子的DNA,用PCR扩增即已可呈阳性，这一点对检测HIV更为重要。常规只要15个拷贝的核酸即可查出。假阳性结果往往来自痕量污染和交叉污染，尤其在待扩增靶序列浓度低的情况下，更有必要采取防备措施。

　　（1）DNA处理最好用硅烷化塑料管以防粘附在管壁上，所有缓冲液吸头、离心管等用前必须高压处理，常规消耗用品用后作一次性处理，避免反复使用造成污染。

　　(2）PCR在超净台内进行，操作前后紫外灯消毒。

　　超净台内设内供PCR用微量离心机、一次性手套、整套移液器和其它必须品；移液品用一次性吸头和活塞的正向排液器，防止移液器基部污染。

　　（3）PCR操作应戴手套并勤于更换。

　　（4）成套试剂，小量分装，专一保存，防止它用。配制试剂用新器具，用后作一次性处理。

　　（5）试剂管用前先瞬时离心（10s），使液体沉于管底，减少污染手套与加样器机会。

　　（6）最后加模板DNA（包括在石蜡油后），马上盖好，混匀，瞬时离心（10s），使水相与有机相分开。加入模板且忌喷雾污染，所有非即用管都应盖严。加模板DNA后应更换手套。

　　（7）实验设阳性、阴性对照。