很早就有用随机引物的PCR，但由于无法有效地控制由随机引物引发的非特异产物的产生，所以一直未能广泛应用。近年来由IJiu等设计的TAIL-PCR(Termal Asymmetric Interlaced PCR)又叫热不对称交错PCR，则解决了这个问题，后来有研究表明，经改良过的TAIL-PCR成功地从突变体中克隆到外源插入基因的旁侧序列，从而为启动子的克隆提供了有效的新方法。
在利用特异引物和随机引物进行PCR中一般有3种产物生成：(1)由特异性引物和简并引物扩增出的产物；(2)由同一特异性弓l物扩增出的产物；(3)由同一简并引物扩增出的产物。在TAIL-PCR反应中，其中后2种目标产物可以通过以嵌套的特异性引物进行的后续反应来消除。
TAIL-PCR的基本原理是利用目标序列旁的已知序列设计3个嵌套的特异性引物(specialprimer，简称sp1，sp2，sp3，约20bp)，用它们分别和1个具有低Tm值的短的随机简并引物(Arbitrarydegenerate prime，AD，约14bp)相组合，以基因组DNA为模板．
根据引物的长短和特异性的差异设计不对称的温度循环，通过分级反应来扩增特异引物(流程如图5所示)。
TAIL-PCR共分3次反应。第一次反应包括5次高特异性、1次低特异、10次较低特异性反应和12个热不对称的超级循环。5次高特异性反应，使sp1与已知的序列退火并延伸，增加了目标序列的浓度；1次低特异性的反应使简并引物结合到较多的目标序列上；10次较低特异性反应使2种引物均与模板退火，随后进行12次超级循环。
经上述反应得到了不同浓度的3种类型产物：特异性产物(I)型和非特异性产物(Ⅰ型和Ⅲ型)。第二次反应则将第一级反应的产物稀释1000倍作为模板，通过10次热不对称的超级循环，使特异性产物被选择地扩增，而非特异产物含量极低。第三次反应又将第二次反应的产物稀释作模板，再设置普通的PCR反应或热不对称超级循环，通过上述3次PCR反应可获得与已知序列邻近的目标序列。
Gento等曾用构建的含有潮霉素抗性基因(hph)的双元表达载体pBIG2RHPH2转化真菌，然后利用TAIL-PCR法克隆得到的真菌转化子基因组DNA的T-DNA插入区的旁侧序列并取得了成功。根据T-DNA区的HPH基因设计了扩增右边界的3个引物HS1～HS3，以及扩增左边界的引物HAS2～HAS4，另外又根据不同的转化子分别设计了简并引物ADl～AD3(引物位置如图6所示)。
在首轮PCR中，以AD/HS1为引物扩增右边界(以AD/HAS2扩增左边界)，然后取首轮PCR产物为模板，以AD/HS2(AD/HAS3)进行二次PCR，再以二次PCR产物为模板，AD/HS3(AD/HAS4)为模板进行第三轮PCR，将3轮的PCR产物进行电泳分析结果表明，采用TAIL-PCR的方法成功地从突变体中获得了带有T-DNA左右边界的旁侧序列，从而证明了TAIL-PCR法是有效地扩增基因旁侧序列的方法，为启动子的克隆又增添了1种可行的方法。
TAIL-PCR不需要PCR前的任何DNA操作，避免了环化和连接，速度快，特异性强，效率高，灵敏，在分子生物学研究的各个领域都有广泛的应用。
2 讨论
以上介绍的几种方法基本代表了现有的启动子克隆方法，它们分别具有不同的特点和适用范围。
利用启动子探针载体筛选启动子时，不需要知道具体的基因序列，避免了引物设计，并能获得大量的启动子片段；其缺点是需要构建1个穿梭质粒，建库、转化、筛选，工作量大，费时费力，而且克隆、亚克隆的过程繁琐。因此在基因的遗传背景不是很清楚时，往往通过探针载体随机筛选启动子。
而PCR法的主要优点是简便、快捷、操作简单；其缺点是只能扩增两端已知序列间的DNA区，且扩增的特异性较低。其适用条件是建立在对基因序列十分清楚的基础上，只有知道基因的全序列，才可根据已知序列设计引物,扩增出该基因的启动子。因此，在基因序列清楚的情况下．我们首先想到的就是PCR法。
I-PCR法操作简单，克服了文库筛选、克隆、亚克隆的繁琐步骤，对实验条件要求不高，花费少，在PCR法的基础上，增加了DNA的环化过程，从而可以扩增只有一端序列已知的DNA，由于不需要设计和合成大量昂贵的核苷酸接头，因此避免了引物设计和有接头而产生的非特异性产物的麻烦；然而由于直接克隆已知序列外的未知DNA区域依赖于DNA的环化性，而环化连接过程中常常产生多联体，成为副产物甚至是主要产物，导致非特异扩增，造成了闭环双链的DNA的PCR扩增效率差，经常得不到满意的结果，同时酶切片段太长也会使扩增效率下降。其适用于寻找只有一端序列已知的DNA,对未知DNA片段进行扩增。
相对于I-PCR，P-PCR经过设计形成的是锅柄状单链DNA模板，从而有效增加了引物与模板结合的特异性，p-PCR能够完成全部嵌套式扩增，因而产物有非常高的特异性；其缺点是也存在DNA环化、连接的弊端，但与I-PCR相比，其PCR产物的特异性已大大增加。目前，P-PCR可以扩增位于已知位点侧翼的大于3.0kb的人基因组DNA的启动子，是目前为止能扩增距离已知序列最远的DNA序列的方法．因而常用于扩增大片段的未知序列。
利用载体的PCR克隆启动子有实验设计简便的优点，在基因组DNA中加入含合适酶切位点的载体，是基于PCR法的又一创新之处；然而其实验操作较为繁琐，特异性差，即使用套式PCR，仍然有几条电泳条带，因而特异性产物需杂交进一步确定。
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