试管婴儿植入前遗传学诊断单细胞PCR的方法

1．根据特异性扩增带做出诊断 这主要对于基因缺失引起的疾病有重要意义。如α一地中海贫血等诊断。根据扩增片段长度的不同可以区分正常组与异常组。此外，为排除PCR反应体系不适造成的假阴性，应在同一反应体系中加入另一对引物扩增其他非缺失序列作为内对照。

2．限制性酶谱直接分析法 限制性内切酶具有识别DNA中特定核苷酸顺序，如某种限制性内切酶，其切点在被检测基因内或外围，酶切后该基因存在于特定长度的片段中，在正常情况下所切出的片段长度是固定的，当基因发生突变后，核苷酸顺序发生改变，就可导致限制性内切酶的酶切位点改变，切点消失或产生新切点，从而使片段大小也发生改变。PCR后，用限制性内切酶切PCR产物，根据电泳后酶切片段长度的变化，即可做出诊断。适用于已知点突变遗传病、基因缺失及基因增加或大片段插入等遗传病的诊断。

3．限制性片段长度多态连锁分析法 指在人群中用同一限制性内切酶消化基因组DNA，可产生不同长度的DNA片段，称为限制性片段长度多态(RFLP)，按孟德尔规律遗传，目前大多数单基因病的基因结构、基因产物以及突变性质等都还不完全清楚，不可能用直接法诊断，这类遗传病可在致病基因附近寻找一个或几个与基因相连锁的DNA多态作为特定遗传标记，通过先证者及其家系成员的分析，但父母必须是RFLP杂合子，就可间接判断致病基因的存在与否，既间接诊断，故称RFLP连锁分析间接诊断。

4．寡核苷酸探针一一斑点杂交检测法 适用于任何已知点突变性质的遗传病，特别是具有遗传异质性的遗传病，如s地中海贫血。方法为针对已知的点突变，合成一对寡核苷酸探针cleotide．probe)，一个为正常基因片段与相应正常序列完全互补；另一个为突变基因片段，与相应的突变基因完全互补。探针经标记后与经PCR扩增后的扩增产物进行斑点杂交，就可直接显示突变基因是否存在，直接做出诊断。早期寡核苷酸探针一一斑点杂交，是先将待检测DNA或PCR产物固定在尼龙膜上，再与寡核苷酸探针一一斑点杂交，但每次只能检测一种突变。后来发展的反向点杂交(re–verse dot blot，RDB)，是将生物素标记的寡核苷酸探针固定在尼龙膜上，再与PCR产物杂交，一次可检测多种突变，大大提高了诊断效率。

5．单链构象多态性(SSCP) 是一种筛选方法，在lOO一500个碱基对中只有一个碱基对的异常时，它也可以发现。在PCR过程中产生的单链，通过链内的相互作用会产生序列特异性形态。一个碱基对的变化就可以使DNA单链显示出根本不同的形态，在聚丙烯酰胺凝胶电泳中会显示不同的条带，从而可以区分正常及异常等位基因。由于有多点突变的复杂杂合子会呈现特异的条带而得以诊断。SSCP是最常用的基因突变诊断方法。因所需仪器设备较少，步骤简便，价格便宜，可以用溴化乙锭或高敏感性的银染的方法代替放射性同位素等优点使SSCP得到广泛应用。但所选的凝胶会影响单链的迁移，从而影响实验结果，温度也是影响因素之一。不同的单链有不同的适宜温度。因此，有可变的凝胶系统是很重要的，可以为不同的突变选择不同的最佳温度。SSCP异源DNA链分析可共同用于家族性结肠息肉的植入前遗传学诊断。因为这两种方法所用凝胶相似，所以可以同时应用。

6．变性梯度凝胶电泳(DGGE) 有一种只用于PGD的技术是变性梯度凝胶电泳(DGGE)，与SSCP一样，是以不同碱基对特异性序列具有不同物理特性为原理的筛选方法。突变序列在聚丙酰胺凝胶电泳中当变性剂浓度增加使具有不同的融化特性，从而影响迁移率。在行DGGE之前的PCR引物中通常增加4O个左右的鸟嘌呤或胞嘧啶残基。这一序列能明显增加DNA片段中变异序列的检出率(检出率为95％)。然而，有时鸟嘌呤或胞嘧啶残基会降低PCR效率，在单细胞水平，可能会使PCR失败。以鸟嘌呤或胞嘧啶残基作为内侧引物进行巢式PCR可以解决这一问题。DGGE植入前遗传学诊断中用于各种类型的s一球蛋白突变的诊断。

7．基因芯片